[发明专利]农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法

权利要求书

1.农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝液制备：培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×10⁶个/ml的菌丝液；

(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的根癌农杆菌菌株EHA105接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3d，用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.15-0.35，继续振荡培养7-8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.53-0.59；所述IM培养基在使用之前，每毫升IM培养基加入4μL 0.2mol/L乙酰丁香酮，1μL 0.01％(w/v)FeSO₄，10μL 100mg/mL 2-(N-吗啡啉)乙磺酸；

(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD₆₀₀为0.53-0.59的农杆菌菌液与1×10⁶个/ml的菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上，置于20-22℃黑暗培养48h，共培养期间不添加乙酰丁香酮；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，5℃黑暗培养至菌落长出。

2.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的步骤如下：配制浓度为1×10⁶个/mL的冬孢子悬浮液，取冬孢子悬浮液涂布于土壤浸提液培养基上，置于温度为5℃、相对湿度为50％的人工气候生长培养箱中进行全光照培养。

3.根据权利要求2所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述土壤浸提液培养基的配方为：称取75g已灭菌的土壤，溶于500ml沸水中，经纱布过滤后取滤液，加入16～18g琼脂，用蒸馏水定容至1L。

4.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述CM固体培养基的配方为：酵母膏1g，酶水解干酪素0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖10g，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，NaCl 0.15g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL。

5.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述IM培养基的配方为：K-buffer 0.8mL，M-N buffer 20mL，1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL，20％葡萄糖(w/v)10mL，20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL，50％甘油(v/v)10mL，补蒸馏水至1000mL；

所述K-buffer的配方为：200g/L K₂HPO₄，145g/L KH₂PO₄；

所述M-N buffer的配方为：30g/L MgSO₄·7H₂O，15g/L NaCl。

6.根据权利要求1-5任一所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述表达载体为pDHT-sk。

7.根据权利要求6所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述LB液体培养基含有100μg/mL的利福平和50μg/mL的卡那霉素。

8.根据权利要求6所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述CM固体培养基含有100μg/mL的潮霉素B和200μg/mL的头孢噻肟钠。