[发明专利]农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法

说明书

本发明涉及小麦矮腥黑粉菌的遗传转化，具体涉及农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法。包括：培养TCK冬孢子，当萌发率≥60％时收集菌丝，配制1×10⁶个/ml的菌丝液；将农杆菌接种于LB培养基中，28℃振荡培养2‑3d，用IM培养基稀释至OD₆₀₀为0.15‑0.35，继续培养7‑8h，用IM培养基稀释至OD₆₀₀为0.53‑0.59；在CM培养基上铺一层无菌玻璃纸，将农杆菌菌液与菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上，20‑22℃黑暗培养48h；然后将玻璃纸转移至新的CM培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，5℃黑暗培养至菌落长出。该方法能够将外源基因成功转入小麦矮腥黑粉菌基因组中并稳定遗传。

技术领域

本发明涉及小麦矮腥黑粉菌的遗传转化，具体涉及农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法。

背景技术

小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn,TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是世界上最具破坏性的小麦病害之一，矮腥黑粉菌通过产生有毒的黑色真菌冬孢子释放鱼腥味的三甲胺，致使小麦减产和品质降低，给小麦生产造成毁灭性的危害。因此，对小麦矮腥黑穗病的防治刻不容缓。有关小麦矮腥黑粉菌的致病基因及致病分子机理尚不清楚，而构建大容量的小麦矮腥黑粉菌转化子库是研究该病菌功能基因及小麦和矮腥黑粉菌互作的基础。

在众多真菌遗传转化方法中，农杆菌介导的转化技术(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)不仅具有操作简便、转化效率高、受体不受限制等优点，而且转化子稳定性好、T-DNA在真菌基因组中多为单拷贝插入。自从1973年Mishra等首次报道真菌遗传转化以来，该技术已在多种真菌的遗传转化中得到广泛应用。1983年，Banks等利用PEG-CaCl₂介导含有氨基糖苷类抗生物素基因质粒转化到玉米黑粉菌的原生质中是黑粉菌转基因研究的开始，之后又有学者利用潮霉素和PEG-CaCl₂方法转化质粒，通过同源或非同源重组的方式整合到玉米黑粉菌基因组中；张新明不仅建立了大麦坚黑粉菌的遗传转化体系并对转化相关因子做了优化，并且还比较了电击法、PEG-CaCl₂和农杆菌介导法(ATMT)对大麦坚黑粉菌的转化效率，证明了ATMT法明显优于其他两种方法。

目前，对于小麦矮腥黑粉菌的研究多集中在形态鉴定和分类，关于根癌农杆菌介导小麦矮腥黑粉菌的遗传转化体系还未建立。鉴于此，利用ATMT方法对小麦矮腥黑粉菌进行遗传转化研究，建立低成本、快速、高效的小麦矮腥黑粉菌转化体系，将为小麦矮腥黑粉菌突变体库的构建、致病分子机制的研究、致病相关基因克隆及功能研究奠定基础。

发明内容

为了促进小麦矮腥黑粉菌致病分子机制的研究，本发明提供一种小麦矮腥黑粉菌的农杆菌转化方法，该方法能够将外源基因成功转入小麦矮腥黑粉菌基因组中并稳定遗传。

本发明请求保护的技术方案如下：

农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝液制备：培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×10⁶个/ml的菌丝液；

(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3d，用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.15-0.35，继续振荡培养7-8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.53-0.59；

(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD₆₀₀为0.53-0.59的农杆菌菌液与1×10⁶个/ml的菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上，置于20-22℃黑暗培养48h；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，5℃黑暗培养至菌落长出。