[发明专利]一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法和试剂盒

说明书

本发明提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法和试剂盒，包括以下步骤:分别提取待测样品的基因组DNA；设计特异性引物，进行LAMP恒温扩增；在LAMP扩增产物中加入荧光染料，观察其颜色变化；和/或，在琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；根据结果，鉴定是否为日本看麦娘。本发明简便易行，检测快速高效，该检测方法所用检测时间仅需1小时左右，而PCR扩增时间较长，大大提高了检测的效率；灵敏度高：该方法的检测下限为5×10^‑3ng/μL，是常规PCR的100倍；准确性高：可直接利用粗提的DNA进行快速检测，大大提高检测的准确性；特异性强。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法和试剂盒。

背景技术

环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种恒温核酸体外扩增技术，该方法利用一套(4种)特异性引物，以识别靶基因的六个特定区域。该技术原理是：在Bst大片段聚合物的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。SYBR GreenⅠ是一种荧光染料，根据反应液中成分的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增产物)时为橙色，阳性(有扩增产物)时为绿色。LAMP的方法优势是在恒温条件下进行，不需要PCR仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，适于苗期杂草的快速诊断及检测。

日本看麦娘(Alopecurus japonicus Steud.)与看麦娘(Alopecurus aequalisSobol.)都属于禾本科看麦娘属，是我国范围内普遍存在的冬季作物田优势杂草，其生活史与作物(如小麦和油菜)相似，可使这些作物产量和质量显著下降。

农田杂草防治宜早不宜迟，这是由于大龄杂草对除草剂的代谢能力远高于苗期杂草，且如果防治失败，杂草得以繁殖下一代，农田土壤种子库中该种杂草的数量将逐渐增加。这个结果将导致来年杂草防除难度加大，同时也会提高抗药性杂草突变株产生的概率。由于同一属内形态学差异较小，对于日本看麦娘与看麦娘的区别往往是到了抽穗开花期才能鉴别，在苗期一般很难区分。因此，农民在杂草防治时往往将这两种杂草归为一类，甚至有时将菵草也与其归为一类，导致用药不当，防除效果不佳。近年来，抗性日本看麦娘已在国内多个省市如江苏、安徽均有发现，且在不同地区日本看麦娘的抗性程度也有差异。因此，在苗期及时区别日本看麦娘、看麦娘不仅有助于指导农民正确用药，也可以降低日本看麦娘的抗性发生水平，减少除草剂用药量。但经检索，目前国内外尚未对苗期日本看麦娘的LAMP快速分子检测有相关报道。

发明内容

本发明针对麦田恶性杂草日本看麦娘、看麦娘苗期难以鉴定，从而导致用药选择不当(尤其是在抗药性发生的种群中)、草害防治效果不佳的现象，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏高的检测方法。根据日本看麦娘的保守基因序列(ITS)，优化反应条件，能对苗期的日本看麦娘进行检测，可以及时发现田间优势种是否是日本看麦娘，从而指导正确田间用药，及时控制苗期的草害，可以减少农民的经济损失，具有很强的实用价值。

本发明提供一种快速鉴定苗期日本看麦娘、看麦娘的分子检测方法，包括以下步骤:

(1)、分别提取待测样品的基因组DNA；

(2)、设计特异性引物，进行LAMP恒温扩增；

(3)、在LAMP扩增产物中加入荧光染料，观察其颜色变化；和/或，在琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；

(4)、根据结果，鉴定是否为日本看麦娘。

优选的是，所述步骤(2)中特异性引物为在日本看麦娘的保守基因ITS上设计的1对外引物和1对内引物。