[发明专利]一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法及其应用

权利要求书

1.一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)分离提取健康人蜕膜间充质干细胞；

b)经基因工程改造后进行悬浮驯化，通过生物反应器悬浮扩大培养，收集大量上清液；

c)通过低温真空冻干技术制成蜕膜间充质干细胞活性因子；

所述的步骤b)中，悬浮驯化方法如下：通过h-siat7e真核表达载体转染蜕膜间充质干细胞，通过无血清悬浮培养培养基不断进行贴壁-悬浮间隔培养筛选出悬浮蜕膜间充质干细胞细胞株，命名为Siat7e-DPMSC，进而通过生物反应器扩大培养，收集培养上清。

2.根据权利要求1所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)中，无血清悬浮培养培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、bFGF、(TGF)-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin、胰岛素、硫酸葡聚糖和BMP-2；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL、胰岛素含量为100～200U/mL、硫酸葡聚糖含量为10～50μg/mL、BMP-2含量为10～50ng/mL。

3.根据权利要求2所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)的无血清悬浮培养培养基中，PDGF-BB含量为80ng/mL；bFGF含量为20ng/mL；(TGF)-β1含量为10ng/mL；EGF含量为10ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为3mg/mL、胰岛素含量为100U/mL、硫酸葡聚糖含量为25μg/mL、BMP-2含量为10ng/mL。

4.根据权利要求1所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)中，贴壁-悬浮间隔培养筛选方法步骤为：将h-siat7e真核表达载体转染后的蜕膜间充质干细胞用无血清悬浮培养培养液先进行贴壁培养，然后用0.25％的胰酶消化收集贴壁和悬浮细胞，再用生物反应器悬浮培养，然后再进行贴壁培养，反复20～30个循环后，收集悬浮细胞进行鉴定，即筛选出Siat7e-DPMSC悬浮细胞株。

5.根据权利要求1所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)中，所述生物反应器为搅拌式生物反应器；反应条件为：搅拌速率40～100rpm，PH值为6-8，溶氧(DO)值为50～80％。

6.根据权利要求7所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤b)中，所述生物反应器为搅拌式生物反应器；反应条件为：搅拌速率50rpm，PH值为7，溶氧(DO)值为60％。

7.根据权利要求1所述的一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述步骤c)中，低温真空冻干技术步骤包括：将收集的培养上清通过3kD的滤膜进行超浓缩，然后通过0.22μm滤网过滤后加入冻干赋型剂，通过程序降温系统降温至-80℃凝固备用；将凝固样本进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存。

8.根据权利要求7中所述一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述的程序降温体系为1℃/min下降至-80℃。

9.根据权利要求7中所述一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述的培养上清经过超浓缩后体积为原上清体积的1/20。

10.根据权利要求7中所述一种大规模生产蜕膜间充质干细胞活性因子的方法，其特征在于：所述冻干赋型剂为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一种，加入量为浓缩液的15～20％v/v。