[发明专利]一株表达多聚磷酸激酶的重组菌及其应用

说明书

本发明公开了一株表达多聚磷酸激酶的重组菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的重组载体，所述重组载体由原始载体及接入原始载体的目的基因构成。本发明提供的用于编码多聚磷酸激酶的碱基序列如SEQ ID No:1所示。本发明的大肠杆菌基因工程菌可以高效表达多聚磷酸激酶，其诱导酶活可达3.92U/mg，该酶表现出良好的催化活性和稳定性，对底物AMP的转化率达到95％以上。本发明还公开了上述基因工程菌在ATP再生过程中的应用，与现有的ATP再生的方法相比，本发明中应用的多聚磷酸激酶可作为单一的酶将AMP再生为ATP，简化了酶的使用，降低了ATP再生的成本。

技术领域

本发明涉及一株基因工程菌，具体涉及一株表达多聚磷酸激酶的重组菌及其应用。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是生物体内最重要的高能磷酸化合物，在临床可用做治疗脑血管疾病、进行性肌萎缩、脑损伤、心机能不全、肾炎、心肌炎及肝炎等疾病的辅酶类药物。在生物催化的过程中，ATP作为生物合成中的能量货币，许多物质的生物合成都需要ATP作为能量的供体，以推动反应的顺利进行。但ATP的价格相对昂贵，若能建立一个适宜的反应系统，在这个系统中，由ATP降解而来的ADP(或AMP)可通过其它途径再合成ATP，使ATP能够循环使用，这样就有可能采用能够再生ATP的廉价底物来替代ATP，从而提高有用物质生产过程的经济性。

目前常用的ATP再生方法有全细胞催化法(如酿酒酵母、产氨棒杆菌和枯草芽孢杆菌等)以及酶催化法(如乙酸激酶、丙酮酸激酶以及多聚磷酸激酶等)，其中能量供体涉及葡萄糖、乙酰磷酸及多聚磷酸等。由于以多聚磷酸盐作为底物具有廉价、稳定、无毒、不产或少量产生副产物等特点，利用多聚磷酸再生ATP体系极具吸引力，因此通过多聚磷酸酶(PPK)进行ATP再生的极具应用前景。不同来源的PPK，催化特点各不相同。如，来源于大肠杆菌的PPK1(EcPPK)已应用于葡萄糖-6-磷酸的生产及低聚糖合成等；来源于Acinetobacterjohnsonii的PPK2(AjPPK2)和来源于Sinorhizobium melilot的PPK2(SmPPK2)分别被用于AMP和ADP的磷酸化；来源于嗜热生物Thermosynechococcus elongates和Thermusthermophilus的重组PPK1被应用于耐高温的ATP依赖型反应中。

相关ATP再生系统的研究报道大部分集中于从ADP起始的ATP再生方法，从AMP起始的ATP再生系统相关研究非常少。所以，亟待找到一种合适的多聚磷酸激酶，能够以单一酶催化AMP和低聚合度的聚磷酸盐生成ATP，使ATP再生过程经济、方便，实现ATP再生体系更广泛的应用。

发明内容

发明目的：为了解决ATP价格昂贵的问题，本发明第一方面提供编码多聚磷酸激酶的PPK基因，本发明第二方面提供含有所述PPK基因的重组载体，本发明第三方面提供含有所述重组载体的重组菌，本发明第四方面提供所述重组菌在表达多聚磷酸激酶中的应用，本发明第五方面提供所述重组菌在ATP再生中的应用。

技术方案：本发明第一方面提供一种编码多聚磷酸激酶的PPK基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列为SEQ ID No:2所示。该PPK基因长度为855bp，编码284个氨基酸和一个终止密码子，编码的多聚磷酸激酶以AMP为底物合成ATP。所述PPK基因来自于节杆菌(Arthrobacter sp.CGMCC No.3584)中，该菌株已公开于中国发明专利申请201010191515.6中。

本发明第二方面提供含有SEQ ID No:1所示PPK基因的重组载体。优选地，所述重组载体为融合型表达载体，优选出发载体为pET28a，所述PPK基因插入pET28a的SalⅠ和NdeⅠ酶切位点之间。

本发明第三方面提供含所述重组载体的重组菌；优选地，所述宿主菌为Escherichia coli Rosetta(DE3)。

其中，重组菌的构建方法如下：