[发明专利]一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，本发明的发明人偶然发现将大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines，简称Xag)的纤维素酶基因通过重组表达载体转入黑曲霉菌中，可以显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力，由此发明了提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，解决了目前黑曲霉的发酵生产纤维素酶方面的技术难题。

技术领域

本发明涉及一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，属于生物工程技术领域。

背景技术

黑曲霉是曲霉属真菌中的一个常见菌种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，也是重要的发酵工业菌种，可用于生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等，是制酱、酿酒和制醋的主要菌种。

黑曲霉是目前食品工业领域应用广泛的菌种，如何提高黑曲霉的纤维素酶产量和酶活力也是本领域的研究人员一直致力于解决的技术难题。例如，通过基因工程的手段导入纤维素外切酶基因，提高外切酶的酶活力，或者敲除一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。

除了黑曲霉以外，黄单胞菌属中不少菌种的基因组中也含有胞外纤维素酶基因，例如，在野油菜黄单胞菌(X.campestris pv.campestris，简称Xcc)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是engXCA；在白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae，简称Xoo)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是clsA(与engXCA基因同源)、eglXoB和cbsA；在柑橘溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri 29-1，简称Xac)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是bglC3；在大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines，简称Xag)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是engXCA基因。

然而，上述这些黄单胞菌属菌株的胞外纤维素酶基因是否可以加以利用来提高黑曲霉的纤维素酶的酶活力，本领域技术人员尚未进行这方面的研究。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，

该方法包括以下步骤：

步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：

所述clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；

所述engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因；

步骤2)构建纤维素酶的表达载体：将所述步骤1)构建的所述clp基因序列和所述engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到表达载体上获得所述纤维素酶的表达载体；

步骤3)将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中，获得重组黑曲霉菌株。

优选的，所述engXCA基因启动子序列中的第-148～-163位点的序列为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'，如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述步骤1)中，clp基因启动子序列如SEQ ID No.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQ ID No.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，在所述步骤2)中，所采用的表达载体为pCAMBIA1300载体。

优选的，在所述步骤2)中，所采用的限制性内切酶为Sma I和Xba I。