[发明专利]一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用，通过遗传学手段对漆酶高产菌株—栓菌AH28‑2进行改造，即在该菌株中过表达热激蛋白ThHspA1，改造后的菌株Trametes hirsuta AH28‑2(ThHspA1‑5)可在添加1/10初始剂量诱导剂的条件下使漆酶产量提高2倍，以该菌株生产漆酶具有高效环保等优点。

技术领域

本发明涉及一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用。

背景技术

真菌漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，广泛分布于高等丝状真菌特别是担子菌中，能够催化数百种酚类和非酚类化合物发生氧化，同时将氧分子还原成水；在小分子介体物质如丁香酸甲酯等的存在下，真菌漆酶的作用底物可进一步拓宽。近年来，随着社会对可持续、环境友好型催化的呼吁和追求，真菌漆酶宽底物谱、以O₂为电子受体副产物为H₂O等方面的催化优势逐渐体现，对真菌漆酶的研究也因此受到各国科研工作者的广泛关注。目前，真菌漆酶在新型药物合成、生物能源炼制、环境污染物脱毒处理、新型生物传感器研制、工业纺织染料转化等现代生物技术工艺中已展现出重要应用潜力。

通常情况下，野生型真菌的漆酶产量较低。为了提高漆酶产量，通常会加入外界诱导剂以使真菌的漆酶产量提高，常用的诱导剂包括芳香族化合物(愈创木酚、阿魏酸、藜芦醇、邻甲苯胺等)、重金属离子(如Cu²⁺、Mn²⁺)以及一些醇类物质(如乙醇、异丙醇)。这些策略在提高漆酶产量的同时，也导致了新的问题，例如上述诱导剂不仅价格昂贵而且有毒性，从而限制了漆酶产业化应用进程。异源表达是提高酶量和进行工业化生产的另一种常用方法。虽然一些真菌漆酶基因已成功实现重组表达，但真菌漆酶的异源表达多存在产量低，发酵周期长且成本高等缺点，难以达到工业化要求。

发明内容

为了克服上述现有技术所存在的问题，本发明旨在提供一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用。

本发明通过遗传学手段对本实验室自行筛选分离的一株漆酶高产菌株—栓菌AH28-2进行改造，即在该菌株中过表达热激蛋白ThHspA1，改造后获得菌株Trameteshirsuta AH28-2 (ThHspA1-5)可以在添加1/10初始剂量诱导剂的条件下使漆酶产量提高2倍，以该菌株生产漆酶具有高效环保等优点。

所述栓菌AH28-2的分类命名为：Trametes sp.AH28-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2005年11月29日，保藏编号：CCTCC NO： M205134。

本发明真菌漆酶表达菌株Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2018年6月12日，保藏编号：CCTCC NO：M 2018329。

本发明真菌漆酶表达菌株的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：ThHspA1过表达载体的构建

1a、从栓菌AH28-2菌株提取基因组DNA，然后以获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列；

通过Primer 5设计扩增ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的PCR 特异引物序列如下：

HspA1-F：CGCGATATCATGACGACGACTGCAGACAGCG；

HspA1-R：ATTGGGCCCGAACTGTACCCGGTCGCGCA；

ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的PCR扩增体系如下，总体系为 50μL。