[发明专利]PD-1特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用

权利要求书

1.一种PD-1特异性干扰序列，其特征在于，所述PD-1特异性干扰序列为序列1、序列2或者序列3；其中序列1的正义链如SEQ ID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示，序列2的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQ ID NO.4所示，序列3的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示；所述的PD-1特异性干扰序列能够用于制备抗黑色素瘤药物。

2.根据权利要求1所述的PD-1特异性干扰序列，其特征在于，在合成PD-1特异性干扰序列之前先设计合成siRNA链，设计原则如下：

(1)siRNA链在PD-1基因启动子100个碱基后选择；

(2)在PD-1基因上选出的5’-AA(N 19)TT-3’的siRNA链，作为siRNA正义链；siRNA反义链序列为其正义链的互补序列；

(3)如果找不出5’-AA(N 19)TT-3’，则用5’-AA(N 21)-3’补足；

(4)如果找不出5’-AA(N 21)-3’，则用5’-NA(N 21)-3’补足；(1)-(3)中N是任何碱基均可，N 19表示有19个碱基、N 21表示有21个碱基；

(5)在所选定的siRNA链中，其GC比在35-55％；

(6)如果找不出满足(1)-(5)要求的siRNA链，则将GC比放宽至30-70％，直至选出满足(1)-(4)要求的siRNA链；

选好siRNA链后，在每个siRNA链两端分别加入BamH Ⅰ及HindⅢ序列，然后再合成PD-1特异性干扰序列。

3.一种携带权利要求1所述的PD-1特异性干扰序列的PD-1特异性干扰质粒，其特征在于，所述PD-1特异性干扰质粒是将PD-1特异性干扰序列连接入pGCSilencer neo2.0-U6质粒后制得的。

4.根据权利要求3所述的PD-1特异性干扰质粒，其特征在于，所述PD-1特异性干扰质粒是由以下方法制备得到的：

S1，合成PD-1特异性干扰序列：

所述PD-1特异性干扰序列为序列1、序列2或者序列3；其中序列1的正义链如SEQ IDNO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示，序列2的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQID NO.4所示，序列3的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示；

S2，制备PD-1特异性干扰质粒：

S2步骤以序列1为例说明PD-1特异性干扰质粒的制备方法，

S21，配制正义链稀释液和反义链稀释液；

S22，正义链稀释液和反义链稀释液退火，制备PD1-siRNA双链；

S23，质粒载体线性化及构建PD-1特异性干扰质粒：

将pGCSilencer neo2.0-U6质粒用Bam H I和Hand III双酶切后，琼脂糖凝胶回收线性化质粒DNA片段，将S22所得PD1-siRNA双链连接到线性化质粒DNA片段上得到PD-1特异性干扰质粒pH1Si-PD-1；

利用序列2和序列3制备PD-1特异性干扰质粒的方法与利用序列1制备PD-1特异性干扰质粒的方法相同，区别在于序列1、序列2和序列3的正义链和反义链核苷酸序列不同。

5.一种减毒沙门氏菌，该菌运载了权利要求3所述的PD-1特异性干扰质粒。

6.根据权利要求3所述的PD-1特异性干扰质粒在制备抗黑色素瘤药物中的应用。

7.根据权利要求5所述的减毒沙门氏菌在制备抗黑色素瘤药物中的应用。