[发明专利]一种农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建

权利要求书

1.一种农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，其特征在于，由以下步骤组成：

1)以米曲霉3.042基因组DNA为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增获得上游片段；以序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的DNA片段为引物执行PCR扩增获得下游片段；以上两种PCR产物为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4的DNA片段为引物执行，PCR将PyrG基因基因上下游拼接到一起；将拼接好的上下游片段连接T载体，测序验证；验证正确后的T载体，通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将拼接好的片段连接双元载体pGreenⅡ，构建好的载体命名为PyrG-pGreenⅡ；将PyrG-pGreenⅡ转化农杆菌AGL1；

2)米曲霉3.042孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子，孢子过滤，然后4000rpm离心10min，蒸馏水洗2次，调整浓度至：1*10⁶个/ml，备用；

3)将步骤1)转化后的农杆菌AGL1接种于10ml同时具有卡娜和利福平抗性的LB液体培养基中，以28℃的温度、200rmp的转速转摇瓶培养；取1ml培养液加9ml IM液体培养基混合，而后液置于28℃的问题，200rmp的转速，摇瓶培养6小时，得到菌液；

4)取100μL步骤3)所得的菌液和100μL步骤2)所得的孢子悬液其浓度为1*10⁶个/ml，混匀共涂到铺有玻璃纸IM固体培养基上，于22℃，避光培养60小时；

5)将玻璃纸转移至筛选培养Ⅰ，然后玻璃纸覆盖一层筛选培养基Ⅱ，30℃培养5-7天；挑取生长出培养基的菌斑至新的筛选培养基Ⅱ和CD培养基；正常米曲霉在CD培养基上可以生长而在筛选培养基不能生长，而PyrG营养缺陷型在CD培养基生长不能生长只能在筛选培养基上生长；

6)挑取在筛选培养基可以生长而在正常CD培养基不能生长的转化子，于CD+Ura/Uri培养基培养，提取DNA，以序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的DNA片段为引物执行和SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7的DNA片段为引物执行扩增，检测ORF是否成功敲除。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，其特征在于：步骤1)中所述上下游片段长度为1500bp。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，其特征在于：步骤1)中上下游片段采用融合PCR融合到一起。

4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，其特征在于：步骤3)所述IM液体培养基是通过以下方法配制的：40mM MES，5mM葡萄糖，0.5％(w/v)甘油和200μM乙酰丁香酮溶于MM盐溶液。

5.根据权利要求5所述的MM盐溶液，其特征在于：每1升MM盐溶液含有以下成分：K₂HPO₄2.05g，KH₂PO₄1.45g，NaCl0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂·6H₂O 0.1g，(NH₄)₂SO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O0.0025g。

6.根据权利要求1所述的农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，其特征在于：步骤3)中，所述1mL该培养液与9mL IM液体培养基混合之后，其OD600值为0.2-0.3。

7.根据权利要求1所述的农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，其特征在于：步骤3)中，所述摇瓶培养6h之后，其中OD600值为0.6-0.8。

8.根据权利要求2所述的农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建方法，其特征在于:步骤6)中，所述GFP特异性引物的序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8所示。