[发明专利]一种农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建

说明书

本发明提供了一种农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，主要包含以下步骤：(1)构建含有PyrG上下游的双元载体；(2)双元载体转化农杆菌AGL1；(3)在DPY培养基培养野生型米曲霉3.042，3天后洗下孢子；(4)孢子与含有目的载体的农杆菌共培养60小时；(5)共培养后的孢子转移到含有头孢，Ura/Uri和5‑FOA的CD培养基筛选；(6)筛选培养基生长出来的转化子单菌落进一步在不同培养基上培养，通过生长表型验证是否为PyrG营养缺陷型；(7)验证后的米曲霉提DNA，进一步PCR验证。本发明首次建立了由农杆菌介导的米曲霉PyrG基因敲除体系；较原来的诱变筛选或者原生质体介导的基因敲除体系减少工作量，提高了敲除效率，构建了一种营养缺陷型米曲霉，可以为其遗传操作奠定了基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及米曲霉转基因体系构建技术，具体涉及到一种由农杆菌介导的米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建，为米曲霉转基因奠定基础。

背景技术

米曲霉作为食品安全级的真菌不仅在传统食品发酵、调味品和酿造等行业中具有十分悠久的应用历史，而且在诸如酶制剂、重组蛋白等现代生物技术产业中应用也日益广泛。米曲霉基因组在2005年已经测序完成，但是其遗传操作相对其他丝状真菌来说比较复杂，使得米曲霉功能基因研究进展缓慢。

对于米曲霉的遗传操作，筛选标记是首要考虑的问题。选择一个合适的筛选标记一方面决定了转基因能否进行，另一方面能够最大限度减少假阳性的概率，使筛选工作量最小化。但是由于米曲霉对G418、潮霉素、寡霉素、博来霉素、腐草霉素、卡那霉素等常用的抗性药物均不敏感，使得米曲霉转化筛选标记主要依赖于营养缺陷型。米曲霉常用于真菌转化的营养缺陷型标记基因有来自真菌的编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶pyrG基因；该基因在米曲霉中存在时可以将非毒性的5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒的5-氟尿嘧啶，从而抑制米曲霉的生长；而该基因敲除时则只能在外源提供uridine/uracil的培养基中生长，因此可以通过5-FOA来筛选pyrG突变体，然后可以通过以uridine/uracil营养缺陷型作为筛选标记进行遗传转化。目前，筛选米曲霉PyrG突变体主要依赖于诱变，然后在含有uridine/uracil和5-FOA的培养基中筛选，而利用转基因敲除主要是依赖于原生质体介导的转基因技术，转化效率低，操作复杂，导致获得营养缺陷型突变体难度大。本发明通过农杆菌介导的转基因技术敲除米曲霉PyrG基因，成功率高，操作简单。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建方法，以解决现有技术中针对米曲霉PyrG营养缺陷型难以获得的问题。

本发明要解决的另一个问题是，常规以原生质体介导的米曲霉转基因来敲除PyrG基因构建营养缺陷型突变体其工作量较大、转化效率较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

农杆菌介导米曲霉PyrG营养缺陷型突变体构建方法，包括以下步骤：

1)以米曲霉3.042基因组DNA为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增获得上游片段；以序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的DNA片段为引物执行PCR扩增获得下游片段；以上两种PCR产物为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4的DNA片段为引物执行，PCR将PyrG基因基因上下游拼接到一起；将拼接好的上下游片段连接T载体，测序验证；验证正确后的T载体，通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将拼接好的片段连接双元载体pGreenⅡ，构建好的载体命名为PyrG-pGreenⅡ；将PyrG-pGreenⅡ转化农杆菌AGL1。

2)米曲霉(3.042)孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子。孢子过滤，然后4000rpm离心10min，蒸馏水洗2次，调整浓度至：1*10⁶个/ml，备用。