[发明专利]一种虫草精多糖在制备用于抗革兰氏阴性植物病原细菌药剂中的用途

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法及其应用。本发明以虫草培养物为原料，提取粗多糖，采用大孔树脂吸附法和Sevag法两种方法相结合的手段去除粗多糖中的蛋白质而得到精多糖。进而采用分步醇沉得到了对三种革兰氏阴性植物病原细菌具有抑制活性的95%乙醇醇沉虫草精多糖CP95。本发明的制备方法具有操作简单、性能稳定、成本低廉的特点，本发明对更好地开发利用虫草培养物，以及降低虫草废弃培养基的清理成本具有重要的经济意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法及其应用。

背景技术

虫草(Cordyceps)是一类复杂的虫菌复合体，包括蝉花虫草、冬虫夏草、蛹虫草等，其含有多种生物活性成分，具有重要的保健和药用价值。蝉花虫草(OphiocordycepsSobolifera，无性世代为蝉棒束孢Isaria cicadae)是由麦角菌科真菌浸染同翅目蝉科蝉类若虫形成的虫菌复合体，因其头部长菌丝形成的无性子实体(又名孢梗束)似花蕾故名蝉花，是中医学中有着悠久药用历史的优质虫草。研究发现蝉花虫草含有多种生物活性物质，主要成分有虫草多糖(Cordyceps polysaccharide,CP)、虫草素、虫草酸、甾醇、尿嘧啶、维生素、生物碱、无机盐矿质元素等，具有调节免疫、抗疲劳、保肾、改善睡眠、抗肿瘤、保肝、抗辐射和明目等多重作用。冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)是冬虫夏草菌寄生于虫草蝙蝠蛾幼虫体后发育成的真菌子座和充满菌丝的僵死幼虫的复合体，含有虫草素、虫草多糖、甾醇、氨基酸等物质，具有免疫调节、抗癌、调节内分泌、抗菌、促进造血、抗病毒和护肝、镇静和抗惊厥作用。蛹虫草(Cordyceps militaris L Link)又名北冬虫夏草、北虫草，具有和冬虫夏草相似的活性成分和药理作用。

天然虫草非常稀少，近年来，人工培养的发展实现了虫草的大规模工厂化培育。虫草培养基是以大米、小麦等粮食作物为主原料，接种虫草菌种，通过固体发酵培养获得虫草培养物，培养物包括上部的无性子实体和底部的培养残基两部分，培养残基由已被转化利用的培养料、菌丝体及分生孢子组成。在实际应用中，一般以采摘开发虫草无性子实体为上品，从而产生了大量的培养残基。经检测，子实体采收后的培养残基因含有大量菌丝体和孢子，富含腺苷、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、多糖、氨基酸及钙、镁、钾、亚油酸等多种物质，也具有一定的应用价值。

发明内容

本发明公开了一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法及其应用。本发明以虫草培养物为原料，提取粗多糖，采用大孔树脂吸附法和Sevag法两种方法相结合的手段去除粗多糖中的蛋白质而得到精多糖。进而采用分步醇沉纯化，揭示了从虫草培养物中提取的95％乙醇醇沉虫草精多糖在抑制革兰氏阴性植物病原细菌方面的用途。

本发明的目的之一是提供一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法。

作为优选的方案，所述方法包括如下步骤：

(1)粗多糖提取：取适量虫草培养物于70℃烘干，按照培养物质量与提取液体积比加入10倍量50％乙醇，于80℃提取两次，每次搅拌0.5h，保温2h，过滤得到50％乙醇提取液；50％乙醇两次提取后的滤渣中加入10倍量水溶液，于100℃提取，搅拌0.5h，保温1h，过滤得到水提取液。将50％乙醇提取液和水提液分别浓缩，得到50％醇提浓缩液和水提浓缩液。两种浓缩液分别加入3倍量95％乙醇，静置过夜，沉淀多糖，分别得到50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖。合并50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖，喷雾干燥，得到虫草粗多糖；

(2)粗多糖脱蛋白：用去离子水溶解粗多糖，将配制的粗多糖溶液上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，收集洗脱液；将收集的洗脱液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作2次；水相层浓缩得到精多糖CP；