[发明专利]一种塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒

权利要求书

1.一种塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗原包被的酶标板，阳性对照血清，阴性对照血清，酶标抗体，样品稀释液，显色液、终止液以及浓缩洗涤液。

2.如权利要求1所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗原经原核表达系统获得，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗原包被的酶标板按照以下方法制备得到：

(1)包被抗原的制备和包被

原核表达系统表达获得的重组蛋白包涵体经复性及Ni-NTA纯化得到塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包被时用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3.5μg/ml，按照100μl/孔包被酶标板，4℃冰箱静置过夜；

(2)酶标板的封闭与保存

酶标板以PBST洗涤3次，按照100μl/孔加入含有5w/v％脱脂奶粉和0.01w/v％硫柳汞的封闭液，37℃封闭1h，弃掉封闭液，PBST洗涤3次，采用铝箔袋真空封口，4℃保存。

4.如权利要求1所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清是经塞尼卡病毒感染后14天的高感染滴度的猪血清；所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清。

5.如权利要求1所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗。

6.如权利要求1所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液为含1w/v％海藻糖，0.01w/v％硫柳汞，0.01v/v％Tween20和0.5w/v％酪蛋白的0.01M磷酸盐溶液。

7.如权利要求1所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的显色液为TMB显色液，所述的终止液为2M H₂SO₄溶液。

8.如权利要求1所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为10×PBST溶液，即含有0.5v/v％Tween20的0.1mol/L PBS溶液，pH7.4，使用时稀释10倍。

9.如权利要求1所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，利用所述的试剂盒进行塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体检测时，按照以下步骤进行：

(1)样本稀释

将待测样本、阳性对照血清以及阴性对照血清用样品稀释液按照体积比1：32进行稀释；

(2)洗板

从4℃冰箱中取出塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗原包被的酶标板，打开铝箔袋，取出酶标板，以稀释好的洗涤液洗板3次，吸水纸拍干，每次3min；

(3)加样

将稀释后的待测样本、阳性对照血清以及阴性对照血清分别加入酶标板中，每孔100μL，37℃孵育45min；

(4)洗涤

取出酶标板，甩掉血清样品，用洗涤液漂洗4次，吸水纸拍干；

(5)加入酶标抗体

加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗，100μL/孔，37℃工作45min；

(6)加底物

甩掉酶标抗体，用洗涤液漂洗4次，吸水纸拍干，加入显色液37℃显色15min，取出后立即加入终止液；

(7)结果判定

在酶标仪上读取OD450nm数值，待测样本的OD450nm值大于等于阴性对照血清平均值的2.5倍判为阳性，小于阴性对照血清平均值的2.5倍判为阴性。