[发明专利]一种基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法

权利要求书

1.一种基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)根据HIV耐药位点序列设计第一轮扩增引物，在第一轮引物加一段通用碱基序列作为第二轮扩增引物，第三轮扩增引物包括第二轮引物的通用碱基序列的一部分、若干个碱基的样本标记序列及若干个保护碱基，并合成三轮扩增引物；

(2)抽提HIV病毒的RNA，并用随机引物进行反转录形成cDNA；

(3)用步骤(1)合成的第一轮扩增引物，对步骤(2)形成的cDNA进行HIV耐药位点的扩增，产生第一轮扩增产物；

(4)用步骤(1)合成的第二轮扩增引物，对步骤(3)所产生的PCR产物进行第二轮扩增，获得第二轮PCR产物；

(5)用步骤(1)合成的第三轮扩增引物，对步骤(4)所产生的PCR产物进行第三轮扩增，获得第三轮PCR产物；

(6)对步骤(5)所获得的PCR产物进行纯化定量，并等摩尔量混合；

(7)对步骤(6)所得混合产物进行长片段文库构建；

(8)对步骤(7)所产生的文库利用PacBio机器测序，产生数据；

(9)对步骤(8)所产生的数据进行数据分析，得到目的信息。

2.根据权利要求1所述的基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，其特征在于步骤(1)中需要设计合成三轮扩增引物，第一轮扩增引物根据HIV的耐药位点序列设计，第二轮扩增引物是第一轮引物序列的5’末端加上若干碱基序列的通用引物，两者组合形成第二轮扩增引物，第三轮引物是将第二轮引物的5’末端所加的通用引物的一部分并在该段引物的5’末端加上14-20个碱基作为样本标记引物，在标记引物的5’端再加1-10个碱基作为保护碱基形成第三轮扩增引物。

3.根据权利要求1所述的基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，其特征在于步骤(2)中反转录的引物使用随机引物进行cDNA的合成。

4.根据权利要求1所述的基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，其特征在于步骤(3)至步骤(5)三轮PCR扩增所需建库的样本。

5.根据权利要求1所述的基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，其特征在于步骤(6)将步骤(5)所得的PCR产物纯化定量，并做等摩尔量混合。

6.根据权利要求1所述的基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，其特征在于步骤(7)对步骤(6)所得的混合扩增产物进行长片段建库，建库步骤包括消化扩增模版的单链核酸，补平末端，末端加A以及连接测序接头。

7.根据权利要求1所述的基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，其特征在于步骤(8)对步骤(7)所产生的文库进行上机测序，上机步骤包括。

8.根据权利要求1所述的基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，其特征在于步骤(9)对于步骤(8)所产生的数据进行数据分析，得到目的信息。