[发明专利]一种基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法

说明书

本发明公开了一种基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，涉及核酸检测领域，方法包括HIV病毒RNA抽提，利用随机引物进行反转录形成cDNA，以cDNA为模板，根据HIV的耐药位点序列所设计的引物进行第一轮PCR扩增目的片段；以第一轮PCR产物为模板，用第二轮扩增引物进行第二轮扩增得到第二轮扩增产物；以第二轮的扩增产物为模板进行第三轮扩增获得扩增产物；对第三轮扩增产物进行纯化定量，等摩尔量混合后进行三代测序文库构建并上机测序；对所得数据进行分析得到每个样本中所包含的序列信息。本发明可以高通量长读长完成多样本中混合的多分子的序列检测，提高了HIV的耐药位点的检测效果、效率及准确性。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及一种于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是一种可感染人类免疫系统的慢病毒，属于逆转录病毒的一种，感染人类免疫系统细胞可导致艾滋病发生。

HIV病毒具有2条相同的正链RNA在5’端通过氢键相互连接在一起形成二聚体，通过逆转录酶逆转录后生成cDNA，与人体细胞的基因组整合实现病毒的复制。由于在HIV的复制过程中，逆转录酶的保真性较差，缺乏3’-5’端外切核酸的校正功能，基因转录在人体免疫或抗HIV药物压力下容易产生错乱，而导致基因突变，因此HIV病毒具有高突变率、高重组率和高复制率的特性，而高不稳定的存在为HIV的治疗带来很大困难，因此对与HIV的耐药区进行核酸序列鉴定是治疗HIV的一种手段。目前对HIV的耐药去进行核酸序列测定比较多的使用PCR方法将耐药位点序列扩增出来直接进行一代测序或者生成克隆后对多个克隆进行一代测序，在使用PCR产物进行一代测序时，由于测序方法灵敏度的限制，突变频率较低的序列在测序峰图上也不能被检测到，而且PCR产物序列的多样性导致一代测序难度加大。通过制备成质粒并对多个质粒进行测序是一种方法，但是此法需要测定大量质粒，且不能保证对所有突变状态都检测到。另外，二代测序能够实现多种序列的覆盖，但是由于读长较短，后续的数据拼接难度较高，不能真实还原原序列的状态。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种对HIV耐药区进行长片段高通量测序的技术，以期解决上述问题。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提出了一种基于长片段测序检测HIV耐药位点突变序列多样性的方法，所述方法主要包括以下步骤：

(1)根据HIV耐药位点序列设计第一轮扩增引物，在第一轮引物的外侧加一段通用碱基序列形成第二轮扩增引物，第三论引物包括第二轮引物的通用序列的一部分、若干个碱基的样本标记序列及若干个保护碱基，并合成三轮扩增引物；

(2)抽提HIV病毒的RNA，并用随机引物进行反转录形成cDNA；

(3)用步骤(1)合成的第一轮扩增引物，对步骤(2)形成的cDNA进行HIV耐药位点的扩增，产生第一轮扩增产物；

(4)用步骤(1)合成的第二轮扩增引物，对步骤(3)所产生的PCR产物进行第二轮扩增，获得第二轮PCR产物；

(5)用步骤(1)合成的第三轮扩增引物，对步骤(4)所产生的PCR产物进行第三轮扩增，获得第三轮PCR产物；

(6)对步骤(5)所获得的PCR产物进行纯化定量，并等摩尔量混合；

(7)对步骤(6)所得混合产物进行长片段文库构建；

(8)对步骤(7)所产生的文库利用PacBio机器测序，产生数据；

(9)对步骤(8)所产生的数据进行数据分析，得到目的信息。