[发明专利]分离红霉素B的方法以及制备红霉素B对照品的方法

说明书

本发明提出了一种分离红霉素B的方法。该方法包括：将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC‑HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾‑乙腈，所述0.01mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm。根据本发明实施例的方法，相比于现有技术，流动相无需调节pH值，节省了时间成本。根据本发明实施例的方法能够高效地将红霉素B从红霉素样品中分离出来，为后续红霉素B对照品的制备奠定了良好的基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及分离红霉素B的方法以及制备红霉素B对照品的方法。

背景技术

红霉素(Erythromycin,简称EM)是一种大环内酯类广谱抗生素。目前已知其中有六种异构体，分别为红霉素A，B，C，D，E和F，A为主要活性成分。红霉素B的理化性质及抗菌谱与红霉素A相似，但抗菌活性却只有红霉素A的30％～60％。

高纯度的红霉素组分对照品对于红霉素的研究工作有着十分重要的意义。

而红霉素A与红霉素B的性质相似，一般的分离手段很难将其分离开来。现有的红霉素B对照品的纯化技术主要为专利CN 102924547 A所提及的纯化方法，该方法主要采用高效液相色谱仪将红霉素B从红霉素样品分离洗脱出来，再将洗脱液pH调为酸性，加入醋酸丁酯萃取，取水相，然后将水相pH调为碱性，用氯仿萃取，取氯仿层，氯仿层再用纯水洗两次，收集氯仿层，蒸干，得到红霉素B，但该方法的纯度最高只有93.4％。

而欧洲药典委员会出售的红霉素B对照品，但价格非常昂贵，不利于普及使用。

因此，红霉素B对照品的纯化方法仍有待开发和改进。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

专利CN 102924547 A所提及的纯化方法步骤繁琐，采用两次萃取，时间成本较高，而且红霉素B为弱极性化合物，水溶性较差，第一步在酸性体系下萃取，红霉素B回收率低，且产品纯度达不到欧洲药典委员会对杂质对照品纯度要求(95％以上)，另外专利实施案例中采用高效液相色谱分离洗脱上样量只有0.1g/针，效率极其低下。基于发明人对现有技术问题的发现和认识，发明人提出了一种改良的红霉素B对照品的制备方法，该方法能够高效、低成本地制备获得纯度95％以上的红霉素B对照品。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离红霉素B的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC-HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾-乙腈，所述0.01mol/L～0.02mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm。根据本发明实施例的方法中流动相采用0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾，其pH约为9.2左右，而红霉素样品本身为碱性化合物，因此，流动相无需调节pH即可用于红霉素样品的分离，相比于现有技术，节省了时间成本。并且发明人发现，该流动相很好的缓冲能力可以使得红霉素样品中各被分离的物质具有良好的峰形，利用该方法还可以实现较高的上样量，根据本发明实施例的方法能够高效地将红霉素B从红霉素样品中分离出来，为后续红霉素B对照品的制备奠定了良好的基础。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：