[发明专利]一种乳酸细菌菌种保藏方法

权利要求书

1.一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备：

A、普通培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃，培养18 h—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于菌种保藏；

B、高密度培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃培养，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH至6.0—6.5之间，培养20—36 h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于乳酸细菌菌种保藏；

（2) 乳酸细菌菌体收集：乳酸细菌保藏菌种培养物进行离心，收集乳酸细菌菌体；设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000 r/min—9000 r/min、离心时间为10 分钟—30分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸细菌菌体备用；

（3）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂：将脱脂牛奶或脱脂奶粉、葡萄糖和蒸馏水在118℃—121℃加压蒸汽灭菌10—15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌；将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/100—1/10的冷冻保护剂混匀制备出活菌数量在10⁹ CFU/mL—10¹¹ CFU/mL乳酸细菌菌悬液；

（4）乳酸细菌菌体包埋粒制备：将添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5 分钟—30 分钟，制备出乳酸细菌保藏菌种包埋粒，包埋粒直径为1 mm—3 mm，包埋材料溶液由2—10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90—98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠与食用明胶的重量配比为1—5:1；包埋材料溶液占50—90份，添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液占10—50份，固化剂为0.1 mol/L—1 mol/L灭菌氯化钙溶液；

（5)乳酸细菌菌体包埋粒低温保藏：将乳酸细菌保藏菌种菌体包埋粒加入灭菌甘油进行混合，甘油体积比浓度为25%—45%，-70℃—4℃低温保存。

2.根据权利要求1所述的一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于：所述乳酸细菌为乳酸杆菌，其保藏培养基组成和重量配比为，蛋白胨5—10份、牛肉浸粉3—8份、酵母浸粉2—6份、葡萄糖5—20份、磷酸氢二钾1—2份、柠檬酸氢二铵1—2份、乙酸钠3—5份、硫酸镁0.1—0.2份、硫酸锰0.02—0.04份、碳酸钙10—20份、吐温-801—2份和水1000份，pH值6.0—7.5，118℃—121℃加压蒸汽灭菌15—20分钟，备用。

3.根据权利要求1所述的一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于：所述乳酸细菌为乳酸球菌，其保藏培养基组成和重量配比为，大豆胨3—5份、蛋白胨2.5—5份、酪蛋白胨2.5—5份、酵母浸粉2—3份、牛肉浸粉3—5份、乳糖3—10份、抗坏血酸钠0.3—0.5份、甘油磷酸钠15—20份、硫酸镁0.2—0.3份、碳酸钙10—20份和水1000份，pH 值6.0—7.5，118℃—121℃加压蒸汽灭菌 15—20分钟，备用。

4.根据权利要求2或3所述的一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于：所述步骤（3）中冷冻保护剂的组成和重量配比为，脱脂牛奶或脱脂奶粉5—30份、葡萄糖0.5—5份、抗坏血酸0.1—1份和蒸馏水100份。