[发明专利]一种乳酸细菌菌种保藏方法

说明书

本发明公开了一种乳酸细菌菌种保藏方法，属于菌种保藏领域，以解决现有方法存在的无法再次长期保藏的问题。包括（1）配制乳酸细菌菌种保藏培养基；（2）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备；（3）乳酸细菌菌体收集；（4）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂；（5）乳酸细菌菌体包埋粒制备；（6)乳酸细菌菌体包埋粒低温保藏。本发明具有保藏乳酸细菌菌种适用范围广、存活率高、保藏期长、携带方便、复苏简便，保藏乳酸细菌菌种活化传代后，可继续保藏重复使用的优点。本发明有效保证了乳酸细菌菌种保藏时的存活数量，保藏方法简便易行，经济适用，也可供其它细菌保藏参考使用。

技术领域

本发明属于菌种保藏领域，具体涉及一种乳酸细菌菌种保藏方法。

背景技术

乳酸细菌是能利用可发酵的碳水化合物产生大量乳酸的一类细菌。这类细菌在自然界分布广泛，种类繁多，它们是研究分类、生物化学、遗传学、分子生物学、基因工程的理想材料，在科研理论上具有重要意义，在工业、农牧业、食品和医药保健等与人类生活密切相关的重要领域中也具有极高的应用价。微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。乳酸细菌与其它微生物一样，菌种保藏就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌，能够长期在研究、生产上应用。为了能较长期地保持菌种的特性，防止菌种的衰退和死亡，人们创造了许多保藏菌种的方法，常用的菌种保藏方法有：定期移植保藏法，石蜡油封藏法，沙土保藏法，真空冷冻干燥保藏法和液氮低温保藏法等。

目前生产或研究日常使用中乳酸细菌菌种保藏方法主要采用试管定期移植保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，缺点是保藏时间较短，保藏的菌种稳定性不好，易发生变异和退化，携带不方便等；长期保存采用真空冷冻干燥保藏法、液氮低温保藏法，但液氮低温保藏法维护成本较高，真空冷冻干燥保藏法需要特殊设备，且菌种在活化过程中为一次性开启，使用完毕后，无法再次长期保藏。

发明内容

本发明的目的是提供一种一种乳酸细菌菌种保藏方法，以解决现有方法存在的无法再次长期保藏的问题。

本发明技术方案如下：一种乳酸细菌菌种保藏方法，包括下列步骤：

（1）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备：

A、普通培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃，培养18 h—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于菌种保藏；

B、高密度培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃培养，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH至6.0—6.5之间，培养20—36 h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于乳酸细菌菌种保藏；

（2) 乳酸细菌菌体收集：乳酸细菌保藏菌种培养物进行离心，收集乳酸细菌菌体；设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000 r/min—9000 r/min、离心时间为10 分钟—30分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸细菌菌体备用；

（3）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂：将脱脂牛奶或脱脂奶粉、葡萄糖和蒸馏水在118℃—121℃加压蒸汽灭菌10—15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌；将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/100—1/10的冷冻保护剂混匀制备出活菌数量在10⁹ CFU/mL—10¹¹ CFU/mL乳酸细菌菌悬液；