[发明专利]一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌的构建方法，其包括导入HtpG基因片段，使其重组耻垢分枝杆菌具有表达HtpG蛋白的功能。本发明通过向耻垢分枝杆菌中导入HtpG基因片段获得抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌，解决了耻垢分枝杆菌表达体系中hsp60启动子需要高温来提高表达活性和高温不利于耻垢分枝杆菌生长的问题。本发明对以耻垢分枝杆菌作为宿主菌表达特定基因的分枝杆菌分子生物学研究、抗结核新疫苗、微生物反应器研发具有重要参考价值。本发明还公开了由该构建方法获得的抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌及用于结核分枝杆菌HtpG基因片段PCR扩增的引物对。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌的构建方法。

背景技术

1884年由Lustgarten首次报道了耻垢分枝杆菌，随后Alvarez和Tavel在生殖器分泌物(smegma，包皮垢)中也发现了该菌，因此被命名为耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)。耻垢分枝杆菌属于放线菌属，也常见于土壤、海洋和淡水环境中。

耻垢分枝杆菌是一种非致病性微生物，与引起结核病的致病菌结核分枝杆菌共有超过2000个同源基因，并具有结核分枝杆菌和其他分枝杆菌相同的细胞壁结构。耻垢分枝杆菌容易在大多数合成或复杂的实验室培养基中培养，3至5天可以形成可见的菌落。而结核分枝杆菌需要数星期才能形成可见菌落，并且常规实验室的防护措施无法保障实验人员的安全，需要较高安全等级的实验室才能进行相关实验内容。上述特性使得耻垢分枝杆菌成为研究致病性分枝杆菌的模式菌株。

耻垢分枝杆菌作为宿主菌表达特定基因的常见用途有：(1)研究特定基因在分枝杆菌生理活动中的功能，例如Zhou等人(Discovery and characterization of Kuacetylation in Mycobacterium smegmatis，FEMS Microbiology Letters，2015.362(6)，fnu051)利用分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒携带Ku基因在耻垢分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis MC²155中进行表达，研究Ku蛋白的翻译后修饰功能；(2)构建抗结核新型疫苗，例如徐志凯等人(发明专利授权号CN101875913B，专利名称为“可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株及其应用”)构建了表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株，应用于结核病预防和治疗；(3)作为微生物反应器，例如张建华等人(发明专利授权号CN102586161B，专利名称为“耻垢分枝杆菌IL-17A及其制备方法”)设计了表达IL-17A基因的耻垢分枝杆菌，用于预防和控制过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤。

hsp60启动子是耻垢分枝杆菌表达体系最常用的启动子之一。Charles KendallStover等人(New use of BCG for recombinant vaccines，Nature，1991.351(6326):456-60)利用hsp60启动子表达lacZ基因，LacZ蛋白达到分枝杆菌总蛋白量的10％以上。D BYoung等人(Heat shock proteins and antigens of Mycobacterium tuberculosis，Infect Immun，1991.59(9):3086–3093)测定了结核分枝杆菌在不同温度培养时，在自身启动子的作用下hsp60蛋白的表达量，发现hsp60蛋白在37℃时占总蛋白的比例小于10％，而在42℃时达到总蛋白的15％。但是周盈等人(乙酰化修饰降低Ku蛋白的DNA结合活性，微生物学报，网络出版时间：2017-09-21)发现耻垢分枝杆菌在平板上生长，42℃培养产生的菌落数量比37℃时的菌落数量低10⁴倍。提高培养温度不利于耻垢分枝杆菌的生长以及hsp60启动子需要提高培养温度来提高表达活性，对于利用耻垢分枝杆菌为宿主菌表达特定基因，是一对相互矛盾的重要参数，目前尚未得到解决。

发明内容