[发明专利]一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法

说明书

本发明提供一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法，属于生物分析检测领域。该方法通过单一小分子荧光探针实现多种临床分离的耐药菌的鉴别，具体按照如下步骤进行：(1)细菌培养；(2)细菌收集：在10000‑14000rpm条件下离心5‑10分钟，弃上清，用20mM、pH＝7.4的HEPES缓冲液清洗细菌2‑3次，最后用HEPES重悬细菌；(3)在待检测细菌中加入荧光探针，用荧光光谱仪检测，以荧光增强(△S/S₀)和荧光比率变化(I₄₈₂/I₃₇₅)作为探针响应的二维信号，用于鉴别不同种类细菌。本发明利用单一小分子荧光探针能够灵敏识别细菌表面的微小变化的性能，实现对不同耐药细菌表面的识别，具有操作简单，检测灵敏快速，普适性强的特点，性能优于已有的耐药细菌检测法。

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法。

背景技术

医院感染是指患者在医院住院期间发生的感染，包括患者住院期间发生的感染或者是在医院内获得出院后又发生感染。医院感染已经成为住院患者最大的威胁，而细菌感染被认为是医院感染最主要的原因之一。引起细菌感染的菌株大多为对抗菌药物耐药的菌株，甚至为多重耐药菌株，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是临床分离中常见的耐药性革兰阳性球菌，其分离率已高达50％以上；而革兰阴性菌中，以表达超广谱β-内酰胺酶(CTX-M-ESBLS)的耐药细菌最为常见，如大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌等。我国对抗菌药物的长期过度使用导致各种耐药细菌的产生，尤其多重耐药细菌引起的各种医院感染人数已占住院患者病原菌感染总人数的30％左右。多重耐药菌感染后给临床治疗带来相当大的困难，甚至引起较高的死亡率。有效的控制患者在医院产生细菌感染的方法是快速、有效的鉴别耐药细菌，随后有目的的用药治疗。

目前常用的耐药菌检测方法是细菌培养基培养或者聚合酶链式反应法分离确定菌种种类，然后通过与多种药物分别孵育培养后检测其最低抑菌浓度(MIC)并确定其耐药性，医院里每天分离出的耐药/非耐药的菌种类众多，这种检测法需要耗费大量的时间与人力。因此急需一种简单快捷，且具有广谱性的检测方法用于耐药细菌的检测。荧光探针具有快速、简单、灵敏、能够实时监测等优点而被广泛应用于细菌的检测。但是目前常用的荧光检测法是将探针分子负载到识别单元，如抗体、适配体、多肽等，通过识别细菌的特定生物靶标来识别细菌。然而，这种方法一种探针只能单一检测某一种细菌，不能同时检测多种细菌而不具有普适性。

细菌表面是有多种组分组成的，细菌基因的任何改变都可能使细胞表面产生微小的变化，因此一种通过监控细菌表面微小变化来区分不同细菌的方法被开发出来。它的响应信号是通过多个具有不同特性的荧光探针与各种细菌表面的非特异性相互作用产生的。多种响应信号通过阵列法形成二维图谱，这种方法被称为二维传感器阵列法。已报道5个具有特殊特性的聚集诱导发光探针作为阵列传感器被用于区分8种细菌。然而，这种方法需要多个化合物的同时使用才能够实现对不同种属微小差异的区分，并且目前还没有探针报道用于鉴别多种耐药菌。同时，这种二维传感器阵列法存在操作繁琐，重复性差，适用范围小的问题。因此，开发一种简单快速的鉴别多种耐药菌的方法是当前的挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法，这一方法利用单一小分子荧光探针与不同细菌表面作用方式的不同，通过探针荧光增强和荧光比率变化作为信号，形成二维图谱来鉴别临床耐药细菌，具有操作简单，检测灵敏快速，普适性强的特点，性能优于已有的细菌检测探针。

一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法，其特征在于采用多种多重耐药细菌荧光探针，按照如下步骤进行：

(1)细菌培养；

(2)细菌收集：在10000-14000rpm条件下离心5-10分钟，弃上清，用20mM、pH＝7.4的HEPES缓冲液清洗细菌2-3次，最后用HEPES重悬细菌；