[发明专利]黄牛RET基因单核苷酸多态性位点的检测方法及其检测试剂盒和应用

说明书

本发明公开了黄牛RET基因单核苷酸多态性位点的检测方法包括以下步骤：以包含RET基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛RET基因；用限制性内切酶MaeI（XspI）消化PCR扩增产物，接着对酶切后的片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果结合测序判定黄牛RET基因第34690位的单核苷酸多态性位点的基因型。本发明还公开了RET基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒在黄牛分子育种中的应用。由于RET基因具有重要生物学功能，该基因单核苷酸多态性对黄牛早期体斜长、体高、胸围有显著影响，可用于黄牛肉用和生长性状的分子标记辅助选择，进而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及黄牛RET基因单核苷酸多态性位点的检测方法及其检测试剂盒和应用。

背景技术

黄牛是我国主要的畜种资源之一，但是现在面临着优秀黄牛品种种源不足和种群遗传品质较差的压力。传统的育种方法基于测定动物的表现型和利用其亲代、祖代及其它亲属在动物模型中的遗传信息实现遗传评估，一般情况下，设想性状受到许多基因遗传差异的影响，因此认为每个基因对性状有相对较小的贡献，结果导致对性状的估计不可避免有些偏差。分子遗传标记是近年来现代遗传学发展最快的领域之一，随着基因组学新方法和新技术的不断涌现，通过对各项技术进行整合，已可从基因即分子水平上进行设计来重构畜禽新品种。基于DNA遗传标记的产生和应用，开创了分子育种的新领域，为动物育种和改良提供了新的技术支撑，给动物遗传育种带来了美好的前景。

肠道是机体吸收营养物质的主要场所，肠道功能的完整性将影响到机体对营养物质的吸收利用，从而影响机体的健康和生长发育。肠道的运动功能主要受局部的肠神经系统(enteric nervous system，ENS)调节，独立于中枢神经系统。ENS由胚胎发育早期的神经嵴细胞通过经过迁移、增殖、分化和定植发育而成，该过程受包括RET原癌基因(ret proto-oncogene，RET)在内的多个基因的调控作用。肠神经节神经系统发育障碍在人上表现为先天性巨结肠症(Hirschsprung’s Disease，HSCR)，发病率约为1/5000，居先天性消化道畸形第二位。该病可导致肠道蠕动功能出现障碍，粪便不能正常通过受累肠段而引起前肠部分粪便堆积，形成巨结肠，严重影响患儿的生长发育，因而受到国内外学者普遍重视。患有先天性巨结肠症的动物，其对营养物质的吸收受到阻碍，可导致营养不良，严重阻碍了机体的生长发育。

RET是最早被发现的，也是最主要的HSCR致病基因。在已确定的可导致HSCR基因突变中，有80％是发生在RET上，这些突变可位于编码区，致病突变也可位于非编码区。因此，在牛上，肠神经节细胞发育关键基因RET的突变，也会导致其肠道功能的异常，影响牛的健康及其生长发育。目前，对于肠神经节细胞发育异常引起巨结肠症的研究主要集中在人和模式动物上，在牛上的研究还未见报道。在家畜中，人们在饲养过程中，会直接淘汰掉有病的个体。但是在种畜选择时，隐性致病突变是无法在外表上直接体现出来，因此，人们无法对HSCR致病突变位点进行筛选。一旦携带有隐性致病突变的个体被选为种畜，其后代就有患病的危险，这在一定程度上会给户主或饲养场带来损失。

SNP作为第三代分子遗传标记，其检测方法中PCR-RFLP由于位点特异性高、操作较简单和成本较低等，广泛运用于植物基因分型、基因定位、分子鉴定等方面的研究。

所以，亟需开发一种黄牛RET基因单核苷酸多态性位点的简单、快速、低成本、精确的检测方法，再将RET基因的SNP及其遗传变异与黄牛生长性状指标进行关联研究，以便用于中国黄牛肉用生长性状的分子标记辅助选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而快速建立遗传资源优良的黄牛品种提供理论基础。

发明内容