[发明专利]一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法

权利要求书

1.一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，首先使用组合酶将马尾松针叶酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。

2.根据权利要求1所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，组合酶含有1-3％vol纤维素酶和0.1-0.5％vol果胶酶。

3.根据权利要求1或2所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取5-25天马尾松实生苗幼嫩针叶，切成细条状备用；

2)5mL组合酶液体系的配制：0.6M甘露醇、20mM MES、50mM KCl、组合酶，10mM CaCl₂和0.1wt％BSA；0.45μm滤膜过滤灭菌；

3)将步骤1)的细条状针叶放入步骤2)制得的酶液中浸透，28℃静置4-6h；

4)在步骤3)的反应液中加入与酶液等体积的W5溶液，于冰上通过200目细胞筛过滤至50mL圆底管中；900rpm，4℃离心5min，吸出上清，再加入1-2mL W5溶液，轻柔摇匀，并用血球计数板计数；置于冰上黑暗静置15min，使原生质体沉于管底吸出上清，并加入MMG或WI将原生质体溶液的细胞浓度稀释成10⁴-10⁶个/mL，并重悬；

5)在EP管中加入5-25μg质粒，100μL步骤4)获得的原生质体悬混液，110μL 15-45wt％PEG溶液；轻柔混匀，室温孵育15-45min；加入1mL W5溶液，混匀后于1000rpm水平离心5min，吸出上清；并加入100μL WI溶液，并于25℃暗培16-24h。

4.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤1)中，取10天的马尾松实生苗幼嫩针叶，切成细条状备用。

5.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤2)中，组合酶为：2％vol纤维素酶，0.125％vol果胶酶。

6.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤3)中，酶解5h。

7.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤4)中，WI溶液组分中甘露醇浓度为0.6M。

8.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤4)中，MMG溶液中甘露醇浓度为0.5M。

9.根据权利要求3所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，其特征在于，步骤5)中，在100μL浓度为10⁶的原生质体中，加入45％的PEG4000、15ng质粒孵化30分钟，使用1mL W5终止反应，在100μL的WI溶液中暗培16-18h。