[发明专利]一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法

说明书

本发明公开了一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，首先使用组合酶将马尾松针叶细胞酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。本发明构建得到马尾松原生质体瞬时表达系统，易于操作和实现，该方法的转化效率可达60％，为马尾松功能基因研究提供了快速便捷的研究平台。本发明所使用的酶解体系适用于马尾松实生苗，利用幼嫩的针叶可得到较高质量的原生质体，原生质体活力可达80％以上，对于野外的成熟叶组织也适用。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana lamb.)，松科(Pinaceae)松属(Pinus)双维管亚属(Subgen.Pinus)油松组(Sect.Pinus)常绿大乔木，原产于台湾，广泛分布于中国中部及以南(包括香港)和越南北部南方等亚热带地区。马尾松不仅是南方重要的材用树种，还是荒山恢复森林的先锋树种，在造林绿化、花粉和次生产物的利用上也有着广泛的应用，具有较高的经济价值和生态价值。

原生质体是进行遗传转化的理想受体，也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料，在细胞工程学、育种学、生物工程学等研究领域都得到了应用。目前，植物原生质体被广泛应用于研究瞬时表达、启动子分析、种质资源改良等领域。近年来，利用原生质体进行亚细胞定位、蛋白互作以及基因沉默与表达等研究在水稻和玉米等模式物种中常有报道。在原生质体瞬时表达系统具有检测快速、通量高等特点，结合报告基因的使用，该技术已被广泛用于目标基因表达、蛋白亚细胞定位、启动子及蛋白活性检测、蛋白与蛋白互作等基因功能分析研究。

早前有关马尾松分子生物学方面的研究多集中在遗传多样性、遗传连锁图谱构建等方面，近年来，随着转录组测序技术的发展，在马尾松中的研究也逐步开始展开。但目前关于马尾松基因组及转录组的数据仍较为缺乏，造成马尾松生长发育相关研究等研究相对滞后。目前马尾松的基因克隆进度多止步于定量验证，在基因功能验证方面的研究平台较为欠缺。由于裸子植物遗传背景的复杂性，以及在组培体系建立的困难，其遗传转化体系的构建上存在较高的难度，在马尾松中还尚未有过文献进行报道。因此，开发马尾松的原生质体酶解体系和瞬时表达体系，对马尾松中的分子克隆和遗传育种的深入研究有着重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，为马尾松的基因功能验证等提供快速便捷的研究平台。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，首先使用组合酶液将马尾松针叶酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG(polyethylene glycol)法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。

所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，组合酶含有1-3％vol纤维素酶和0.1-0.5％vol果胶酶。

所述的马尾松针叶原生质体分离纯化以及瞬时高效转化的方法，包括如下步骤：

1)取5-25天马尾松实生苗幼嫩针叶，切成细条状备用；

2)5mL组合酶液体系的配制：0.6M甘露醇、20mM MES、50mM KCl、组合酶，10mMCaCl₂和0.1wt％BSA；0.45μm滤膜过滤灭菌；

3)将步骤1)的细条状针叶放入步骤2)制得的酶液中浸透，28℃静置4-6h；