[发明专利]非结构蛋白NSP4、重组杆状病毒液及制备、粘膜佐剂

权利要求书

1.一种轮状病毒非结构蛋白NSP4，其特征在于，所述轮状病毒的非结构蛋白NSP4的序列为SEQ ID NO：1。

2.一种由权利要求1所述轮状病毒非结构蛋白NSP4得到的重组杆状病毒液。

3.一种如权利要求2所述重组杆状病毒液的制备方法，其特征在于，所述重组杆状病毒液的制备方法包括：

(1)利用基因合成的方法人工合成轮状病毒NSP4基因序列，将鉴定正确的重组质粒pFastBac-NSP4作为供体质粒，将NSP4基因转座到重组AcBacmid上，用M13引物鉴定转座的成功后将阳性克隆命名为Bac-NSP4；

(2)抽提重组Bacmids，在脂质体介导下，将重组杆粒Bac-NSP4转染对数生长期昆虫细胞sf9，普通光学显微镜下观察，待细胞存活率降到约30％时，收集培养基上清，3000r/min离心10min，收集上清，即为P1代重组杆状病毒液；

(3)提取病毒基因组，用NSP4基因引物进行PCR鉴定，确定所获得的杆状病毒是携带了目的基因NSP4的重组杆状病毒；用P1代病毒感染新的sf9细胞，获得P2代病毒液。

4.一种如权利要求2所述重组杆状病毒液的滴度测定方法，其特征在于，所述重组杆状病毒液的滴度测定方法包括：用噬斑的方法检测重组杆状病毒的滴度，将病毒10倍系列稀释后接种于6孔板中的sf9细胞，病毒吸附1.5h后，弃病毒稀释液，每孔加入2ml含中性红的噬斑培养基，27℃倒置培养，出斑后经结晶紫染色，按照噬斑测定病毒滴度公式计算出重组杆状病毒的滴度；

滴度＝1/稀释倍数×空斑数×1/接种量；滴度单位为：pfu/ml；接种量单位为ml。

5.一种如权利要求2所述重组杆状病毒液的类病毒颗粒的包装及纯化方法，其特征在于，所述重组杆状病毒液的类病毒颗粒的包装及纯化方法包括：重组杆状病毒AcMNPV-NSP4按MOI＝5感染sf9细胞，27℃培养72h；以2 000r/min离心10min收集细胞，去除培养基，用PBS回溶沉淀，于－80℃反复冻融3次，加入NP40裂解液，静置4℃反应30min后，12000r/min离心30min，收集上清液；将上清液轻轻铺到连续蔗糖密度梯度(20％～50％上部，180000r/min 4℃离心6h，弃上清，用PBS缓冲液回溶沉淀，即为纯化后的蛋白溶液。

6.一种由权利要求1所述轮状病毒的非结构蛋白NSP4制备的粘膜佐剂。

7.一种由权利要求6所述粘膜佐剂制备的粘膜疫苗。