[发明专利]非结构蛋白NSP4、重组杆状病毒液及制备、粘膜佐剂

说明书

本发明属于以免疫刺激添加剂，例如化学佐剂为特征技术领域，公开了一种非结构蛋白NSP4、重组杆状病毒液及其制备方法、粘膜佐剂，本发明的Bac‑to‑Bac杆状病毒表达系统具有安全性高、容量大、快速高效等优点；Bac‑to‑Bac杆状病毒表达系统经过优化后，可根据蓝白斑进行筛选，不存在野生型和非重组型病毒交叉污染的问题，不需要再通过空斑来纯化病毒，这使其在疫苗研究中更具有优势。本发明利用Bac‑to‑Bac杆状病毒表达系统表达轮状病毒非结构蛋白NSP4，经蔗糖密度梯度离心纯化后，电镜观察可见大量形态规则，大小约为24～30nm的病毒样颗粒。

技术领域

本发明属于以免疫刺激添加剂，例如化学佐剂为特征技术领域，尤其涉及一种非结构蛋白NSP4、重组杆状病毒液及其制备方法、粘膜佐剂。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：制备安全、高效的粘膜疫苗是当代疫苗发展的一个新趋势，多数蛋白抗原通过粘膜免疫途径接种时诱导的机体免疫应答不足是粘膜疫苗存在的最主要问题。提高粘膜免疫的效果,重点在于免疫佐剂及抗原呈递系统的优化，而疫苗佐剂是制约新型疫苗发展的最主要瓶颈之一。理想的佐剂显著减少抗原使用的剂量，有效诱导机体产生早期、高效和持久的免疫应答，并具有良好的安全性。因此，发现具有潜在佐剂活性的化合物组分，继而筛选和优化，并对佐剂的作用特点及作用机制进行研究，是研发安全、高效的粘膜疫苗，有效防控粘膜感染所致传染病的一个关键环节。目前的粘膜免疫佐剂研究中，以霍乱毒素(Cholera toxin,CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labileenterotoxins produced by Escherichia coli,LT)为代表的细菌肠毒素是研究广泛，也最为有效的增强粘膜免疫应答的免疫刺激分子。CT和LT强有力的粘膜佐剂活性已被大量实验证明，然而两者的固有毒性却阻碍了它们在人体的应用。经滴鼻免疫的LT和CT可能在脑内聚集，从而引发神经毒性的相关研究。随后对CT和LT的一系列减毒突变体或者亚单位进行的研究虽然证实了这些减毒突变体类似的粘膜佐剂活性，但总的来讲其佐剂效应都较全蛋白明显减弱。

综上所述，现有技术存在的问题是：以霍乱毒素(CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)强有力的粘膜佐剂效应都较全蛋白明显减弱。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种非结构蛋白NSP4、重组杆状病毒液及其制备方法、粘膜佐剂。

本发明是这样实现的，一种轮状病毒非结构蛋白NSP4，所述轮状病毒的非结构蛋白NSP4的序列为SEQ ID NO：1。

本发明的另一目的在于提供一种由所述轮状病毒非结构蛋白NSP4得到的重组杆状病毒液。

本发明的另一目的在于提供一种所述重组杆状病毒液的制备方法，所述重组杆状病毒液的制备方法包括：

(1)利用基因合成的方法人工合成轮状病毒NSP4基因序列，将鉴定正确的重组质粒pFastBac-NSP4作为供体质粒，将NSP4基因转座到重组AcBacmid上，用M13引物鉴定转座的成功后将阳性克隆命名为Bac-NSP4；

(2)抽提重组Bacmids，在脂质体介导下，将重组杆粒Bac-NSP4转染对数生长期昆虫细胞sf9，普通光学显微镜下观察，待细胞存活率降到约30％时，收集培养基上清，3000r/min离心10min，收集上清，即为P1代重组杆状病毒液；

(3)提取病毒基因组，用NSP4基因引物进行PCR鉴定，确定所获得的杆状病毒是携带了目的基因NSP4的重组杆状病毒；用P1代病毒感染新的sf9细胞，获得P2代病毒液。