[发明专利]蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用

权利要求书

1.一种蛋白交联纳米硅的制备方法，其特征在于：采用Annexin V蛋白或Tim 4蛋白修饰羧酸化纳米硅球制得蛋白交联纳米硅,包括以下步骤：

将羧酸化纳米硅球加入到DMF中，得到M1；

向M1中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二异丙基乙胺，混合搅拌，得到M2；

对M2进行离心过滤，并将过滤后的沉淀采用盐酸水溶液洗涤，得到纳米硅活性酯；

将Annexin V蛋白或Tim 4蛋白加入到磷酸缓冲溶液中，再加入上述得到的纳米硅活性酯，搅拌后离心取沉淀并洗涤，即得蛋白交联纳米硅。

2.根据权利要求1所述的蛋白交联纳米硅的制备方法，其特征在于：所述羧酸化纳米硅球的直径为200nm-50μm。

3.一种采用如权利要求1-2任一项所述的制备方法所制得的蛋白交联纳米硅。

4.一种采用如权利要求1-2任一项所述的蛋白交联纳米硅的外泌体分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

取外泌体粗提液，加入蛋白交联的纳米硅；再加入CaCl₂混合后，进行离心分离，得到沉淀P1；采用缓冲液洗涤后干燥，得到P2；加入洗脱液与P2混合，并静置一段时间后，收集上清液，即得到分离纯化后的干细胞外泌体;

所述蛋白交联的纳米硅为Annexin V 蛋白交联的纳米硅时，加入终浓度为15mmol/LCaC1₂，所述缓冲液为Ca-HEPES缓冲液，其包括了10 mM HEPES、1mM MgCl₂、5mM KCl、2%BSA、15mM CaCl₂和150mM NaCl，所述HEPES的pH 为7.5；

所述蛋白交联的纳米硅为Tim4蛋白交联的纳米硅时，加入终浓度2mmol/L CaC1₂，所述缓冲液包括20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.0005% Tween20和2mM CaCl₂，所述Tris-HCl的pH 为7.5；

所述洗脱液包括了Tris-HCl、NaCl和EDTA。

5.根据权利要求4所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述外泌体包括间充质干细胞外泌体。

6.根据权利要求5所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。

7.根据权利要求4所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：

将得到的所述干细胞外泌体进行冷冻保存，以备用。

8.根据权利要求7所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述加入CaCl₂混合后，离心分离的温度为4℃。

9.根据权利要求7所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于，所述外泌体粗提液的制备方法包括：收集外泌体细胞培养液上清于离心管中，在4℃条件下500-1000g离心5-10min后，收集离心管上清液；

于4℃条件下，以10000g离心1h去除细胞碎片和蛋白聚合物及大细胞外囊泡后，将收集的上清液过滤后，即得到外泌体粗提液。

10.根据权利要求9所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：去除细胞碎片和蛋白聚合物及大细胞外囊泡后，将采用收集的上清液过0.22μm滤膜后，即得到外泌体粗提液。

11.根据权利要求7所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于，所述冷冻保存的方法为：向分离纯化后的干细胞外泌体中加入5-50 mM D(+)-海藻糖二水合物后进冻存。

12.根据权利要求11所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：向分离纯化后的干细胞外泌体中加入5-50 mM D(+)-海藻糖二水合物后，于-80℃下冻存12-24h，转移至真空冻干仓冻干，得到干细胞外泌体冻干粉，再于4℃条件下避光保存。