[发明专利]蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用

说明书

本发明提供一种蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用，其中，蛋白交联纳米硅为采用Annexin V蛋白或Tim 4蛋白修饰羧酸化纳米硅球制得。通过本发明制备的蛋白交联纳米硅用作干细胞外泌体的分离纯化，能够快速且大规模分离样品中的干细胞外泌体，并保证分离后的干细胞外泌体具有较高的纯度，在干细胞外泌体的制备领域具有极其重要的意义。而通过本发明提供的外泌体分离纯化方法所制备的外泌体在制备与外泌体相关药物上的应用，如在制备神经损伤、心脏修复等药物上的应用，能够节省大量的时间和成本，保证了药物的质量，具有极大的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种蛋白交联纳米硅及制备方法和外泌体分离纯化方法及应用。

背景技术

外泌体(Exosomes)是细胞经过内吞-融合-外排等一系列调控过程而形成的直径在30～150nm的圆形单层膜结构的细胞外小囊泡。外泌体由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中，可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。外泌体的发现丰富了研究者们对细胞间通讯方式的认识，加深了对机体生理、病理过程的理解，2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞囊泡方面贡献突出的科学家，使外泌体的研究达到全新的高度。

间充质干细胞来源的外泌体是干细胞分泌产生的细胞外囊泡，可通过选择性的转运蛋白质、mRNA、microRNA来充当间充质干细胞与已分化细胞的信号分子。现有研究已证明间充质干细胞外泌体在减少心肌梗死面积，减轻肢体缺血，增进伤口愈合，改善移植物抗宿主病，减少肾损伤，促进肝再生，促进皮肤细胞再生、减轻视网膜损伤，以及最近改善软骨和骨再生等方面具有重要作用。

通常，为获取纯度高的外泌体，需要应用到外泌的分离技术。目前外泌体的分离技术有超速离心法、分子排阻法、免疫捕获法、PEG沉淀等方法。超速离心一般需要7小时以上，且耗时耗力；分子排阻法即免疫捕获法所收集的外泌体量少，且费用高昂；PEG沉淀法虽然可以大规模分离外泌体，但是在收集到大量外泌体的同时不可避免的引入脂蛋白，造成分离所得外泌体纯度低的问题。如何寻求一种能够高效分离外泌体并保证外泌体纯度的方式是本技术领域迫切需要解决问题。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的问题，本发明提供一种蛋白交联纳米硅的制备方法，采用Annexin V蛋白或Tim 4蛋白修饰羧酸化纳米硅球制得蛋白交联纳米硅。

具体地，将羧酸化纳米硅球加入到DMF中，得到M1；所述DMF为N，N-二甲基甲酰胺；

向M1中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二异丙基乙胺，混合搅拌，得到M2；

对M2进行离心过滤，并将过滤后的沉淀采用盐酸水溶液洗涤，得到纳米硅活性酯；

将Annexin V蛋白或Tim 4蛋白加入到磷酸缓冲溶液中，再加入上述得到的纳米硅活性酯，搅拌后离心取沉淀并洗涤，即得蛋白交联纳米硅。

进一步地，所述羧酸化纳米硅球的直径为200nm-50μm。

本发明还提供一种采用如上任意所述的蛋白交联纳米硅制备方法所制得的蛋白交联纳米硅。

本发明还提供一种采用如上任意所述的蛋白交联纳米硅的外泌体分离纯化方法。

进一步地，所述外泌体包括间充质干细胞外泌体。

进一步地，所述间充质干细胞外泌体包括脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。

进一步地，包括以下步骤：