[发明专利]一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用

说明书

本发明提供了一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用。本发明在利拉鲁肽前体分子Arg34G LP‑1(7‑37)的N端设计信号肽和肠激酶酶切位点与之紧邻，C端连接终止密码子，三者构成目的基因，然后插入到表达载体两个酶切位点之间，构建表达利拉鲁肽前体的重组工程菌，将工程菌进行高密度发酵培养，以融合蛋白的包涵体形式表达，重组融合蛋白表达量高，重组融合蛋白约占菌体总蛋白的25％‑35％，目的蛋白包涵体表达量达15‑20g/L。包涵体杂蛋白含量低，利于分离纯化，纯化效率高，且稳定性好，极大地降低了生产成本，提高了生产效率，在糖尿病治疗药物制备领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种高效表达利拉鲁肽的重组工程菌及其应用。

背景技术

近年来科学家们依据胰高血糖素样肽1(GLP-1)具有促进胰岛素分泌，调节血糖的生理机制，基于2型糖尿病患者具有GLP-1分泌缺陷，导致高血糖的病理机制，研制出GLP-1受体激动剂。GLP-1在治疗2型糖尿病(T2DM)方面具有巨大的优势：①依赖人体血糖浓度升高情况调控机体血糖；②促进胰岛β细胞增殖分化，抑制其凋亡，促进胰岛素的分泌，提高机体胰岛素敏感性；③抑制胃肠排空、增加饱腹感，减少进食、减轻体重。但唯一的不足是GLP-1在人体很容易被二肽基肽酶降解，它的体内半衰期只有短暂的几分钟，这就限制了的临床运用，所以开发各种长效GLP-1类似物成为近20年的研究热点，利拉鲁肽则是具有这些特点的治疗2型糖尿病的药物。

利拉鲁肽(liraglutide，商品名victoza)，是诺和诺德公司研发的一种每日皮下注射一次的酰胺化长效GLP-1类似物，在结构上，它是将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg，并且在Lys26侧链上连接一条16碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)而得到的衍生物，与天然GLP-1有97％的同源性。在生产工艺方面，利拉鲁肽目前是由诺和诺德公司利用酿酒酵母以胞外分泌方式表达利拉鲁肽前体分子Arg34GLP-1(7-37)，并在其Lys26连接脂肪酸侧链后切除多余氨基酸，获得利拉鲁肽分子，再进一步加工制备成注射液，并以进口药形式在中国销售，价格相当昂贵，多数患者难以承担。

目前对于外源基因的表达可以采用原核表达和真核表达系统进行，但真核表达系统在表达目的蛋白时存在一些缺陷，例如：(1)利用酵母表达目的蛋白时会造成产物蛋白的不均一降解、信号肽加工不完全、多聚体形成等问题。而且，酿酒酵母表达蛋白时会出现蛋白切割问题、蛋白分泌效率低等问题。(2)昆虫杆状病毒表达系统也存在着一定的缺陷。例如，随着感染宿主的多角体病毒的死亡，异源蛋白不能连续表达。每一轮新蛋白的合成都需要重新感染宿主细胞。此外，虽然杆状病毒表达系统能够对目的蛋白做翻译后修饰，但这种修饰存在着一定的限度；虽然其糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样，但寡糖链的性质有所不同，无法产生复杂的糖基侧链，这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加工成哺乳动物细胞中类似的形式。(3)哺乳动物表达系统在表达外源基因时存在成本相对较高，技术复杂，表达过程中存在着潜在的动物病毒的污染等。

原核表达系统方面，大肠杆菌表达系统是研究最为深入，发展最迅速的表达系统，其遗传学背景、基因表达调控机理清晰，表达载体及宿主菌种类繁多，常被用于多肽和蛋白质的表达，是目前首选的外源表达系统。大肠杆菌表达系统由表达载体、外源基因和宿主菌组成，表达载体是其中的核心部分，其普遍的共性是：重组质粒拷贝数高，表达量高；适用范围广；表达产物容易纯化；在菌体内稳定性好。目前已知并应用较广的大肠杆菌表达载体主要分为非融合表达载体、融合表达载体、分泌型表达载体和表面呈现表达载体等，很大程度地改善了重组外源蛋白表达量不高以及下游分离加工难度大等问题。其中融合蛋白表达技术的表达模式是：原核启动子→SD序列→起始密码子→原核结构基因片断→目的基因序列→终止密码子，是比较常用的表达载体，尤其适用于小分子多肽和蛋白的表达，并能显著提高重组蛋白的表达成功率及表达量。