[发明专利]一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用

说明书

本发明公开了一种赖氨酸脱羧酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，为如下(1)和(2)中的任意一种：(1)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；(2)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。本发明提供的赖氨酸脱羧酶突变体其在耐碱及催化性能方面有大幅度提高，更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。

技术领域

本发明涉及赖氨酸脱羧酶的突变，具体涉及一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用。

背景技术

尼龙(PA)，作为工程塑料中最大最重要的品种，具有很强的生命力，主要在于它改性后实现高性能化，其次是汽车、电器、通讯、电子、机械等产业自身对产品高性能的要求越来越强烈。相关产业的飞速发展，促进了全球市场对尼龙需求量的不断提高。当前，传统尼龙材料都来源于石油产品，难以做到可持续性无疑是一个明显的缺陷。出于对全球环境问题的担忧和持续增加的废弃物处理难度的考虑，生物基尼龙材料是最理想的替代性材料。1,5-戊二胺作为生物基尼龙材料的重要单体，其工业化的生物合成也是必然趋势和一个亟待解决的问题。

赖氨酸脱羧酶(简称LCD)是一种生物体内高度专一性酶，能够催化赖氨酸脱去一个CO₂分子，生成1,5-戊二胺的胞内酶。其来源广泛，在芽孢杆菌(Bacillus)、大肠杆菌(E.coli)、毛链霉菌(Streptomyces polosus)、峰房哈夫尼菌(Hafnia alvei)等微生物中都有发现LCD的存在。该酶需要磷酸吡哆醛(PLP)作为其辅酶，帮助其完成脱羧反应。

赖氨酸脱羧酶主要分为组成型酶LdcC和诱导型酶CadA(又称LdcI)，尽管LdcC具有更为广泛的最适pH值，但是其催化活性和稳定性比较差，因此很少用于赖氨酸的脱羧反应。与此相反，CadA由于较高的表达水平及更高的催化活性，通常用于戊二胺的生产。然而，在脱羧酶反应的情况下，一分子的赖氨酸被脱羧就会消耗一个质子，戊二胺的大量积累也伴随着反应体系pH的逐渐增加，这对于CadA的酶活及稳定性来说是不利的。在大肠杆菌本体天然途径中，CadA通常由细胞生长的酸性发酵产物如乙酸等引起的细胞质pH降低而诱导表达的。因此，与其他酶相比，CadA的结构稳定性及活性对于pH的变化十分敏感。虽然目前CadA被广泛用于戊二胺的生产研究，但是克服其原有的不稳定性对于开发戊二胺的工业化生产是必不可少的。

据报道，赖氨酸脱羧酶CadA本身是一个二聚体的结构，在行使功能的时候则是一个十聚体的结构，而当pH逐渐上升的时候，CadA会自动发生一个解聚的过程，变为二聚体的结构，此时，CadA的催化活性急剧下降。

发明内容

发明目的：为了解决现有的赖氨酸脱羧酶在高pH下耐受性能弱的问题，本发明第一方面提供了一种赖氨酸脱羧酶突变体，第二方面提供了赖氨酸脱羧酶突变体的编码基因，第三方面提供了赖氨酸脱羧酶突变体的表达及应用。

技术方案：本发明第一发明提供了一种赖氨酸脱羧酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶通过定点突变得到，定点突变方法为如下(1)和(2)中的任意一种：

(1)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第12位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第41位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体V12C/D41C；

(2)将氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的赖氨酸脱羧酶的第89位的亮氨酸突变为半胱氨酸，第442位的亮氨酸突变为半胱氨酸，得到赖氨酸脱羧酶突变体L89C/L442C。