[发明专利]一种利用紧穗野生稻叶片为外植体获得再生植株的方法

权利要求书

1.一种利用紧穗野生稻叶片为外植体获得再生植株的方法，其特征在于，包括前处理、诱导培养、增殖培养、分化培养、壮苗培养、生根培养和炼苗移栽步骤，具体包括：

A、前处理：选择新长出的紧穗野生稻叶片，清洗后灭菌备用；

B、诱导培养：将前处理后的新叶片切成0.5~0.8cm接入诱导培养基上，于温度25~30℃下暗培养10~20天得到诱导愈伤组织；诱导培养基为：MS 4~4.5g/L+2,4-D 6~8mg/L+琼脂粉8~10g/L+蔗糖20~40g/L，pH 5.8~6.0；

C、增殖培养：将诱导愈伤组织切成0.3~0.6cm接入增殖培养基中，于温度25~30℃暗培养20~30天得到增殖愈伤组织；增殖培养基为：MS 4~4.5g/L+2,4-D 4~6mg/L+琼脂粉8~10g/L+蔗糖20~40g/L，pH 5.8~6.0；

D、分化培养：将增殖愈伤组织切成1.2~1.5cm接入分化培养基中，于温度25~30℃、光照为1500~2500Lx下进行弱光培养20~30天后，再换相同分化培养基一次，于温度25~30℃、光照为1500~2500Lx下进行弱光培养10~20天得到小苗；分化培养基为：MS 4~4.5g/L+6-BA 4~5mg/L+ZT 2~4mg/L+NAA 0.02~0.04mg/L+植物凝胶2.5~3g/L+蔗糖20~40g/L，pH 5.8~6.0；

E、壮苗培养：将小苗接入壮苗培养基中，于温度25~30℃、光照为2500~3500Lx下进行光照培养20~30天得到健壮无根苗；壮苗培养基为：MS 4~5g/L+6-BA 2~4mg/L+TDZ 2~4mg/L+NAA 0.02~0.04mg/L+植物凝胶2.5~3g/L+蔗糖20~40g/L，pH 5.8~6.0；

F、生根培养：将健壮无根苗接入生根培养基中，于温度25~30℃、光照为3500~4500Lx下进行光照培养10~20天得到生根苗；生根培养基为：MS 4~5g/L+NAA 0.4~0.6mg/L+植物凝胶2.5~3g/L+蔗糖10~20g/L，pH 5.8~6.0；

G、炼苗移栽：将生根苗的根部培养基冲洗干净，加水淹没根部，于温度25~30℃、光照为1500~2500Lx下过渡培养2~4天，然后在加入腐殖土继续培养8~12天至长出新根，即刻移栽大田中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，A步骤中所述的清洗是将新叶片用自来水冲洗20~30min，再用蒸馏水冲洗2~4次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，A步骤中所述的灭菌是用体积百分浓度8%的次氯酸钠处理8~12min，倒掉次氯酸钠，再加入体积百分浓度5%的次氯酸钠处理5~7min，倒掉次氯酸钠，无菌水洗6~7次，用无菌吸水纸吸干表面水分。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基为：MS 4.43g/L+2,4-D7mg/L+琼脂粉9g/L+蔗糖30g/L，pH 5.8。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基为：MS 4.43g/L+2,4-D5mg/L+琼脂粉9g/L+蔗糖30g/L，pH 5.8。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化培养基为：MS 4.43g/L+6-BA4.5mg/L+ZT 3mg/L+NAA 0.03mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述壮苗培养基为：MS 4.43g/L+6-BA3mg/L+TDZ 3mg/L+NAA 0.03mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH 6.0。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为：MS 4.43g/L+NAA0.5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖15g/L，pH 6.0。