[发明专利]HTLV-1/2抗体的快速检测方法

权利要求书

1.一种HTLV-1/2抗体的快速检测方法，其特征在于，该检测方法不用于疾病的诊断，该检测方法包括以下步骤：

1)选取目的基因，并构建重组表达菌株；

2)进行重组表达菌株的诱导表达、纯化及活性鉴定；

3)制备金磁纳米微球，并进行功能化修饰；

4)制备层析试纸条；

5)进行HTLV-1/2抗体检测；

所述步骤1)具体包括：确定选取HTLV-1的gp46、gp21，HTLV-2的gp46及HTLV-1/2作为目的基因后，选择具体抗原表位序列为：

HTLV-1-gp46，162aa-109aa，Sequence ID：AAC35409.2；

HTLV-1-gp21，62aa-105aa，Sequence ID：AAA65883.1；

HTLV-2-gp46，31aa-74aa，Sequence ID：ADN52094.1；

确定抗原表位氨基酸序列后，从NCBI调取基因序列，同时将这三个基因通过基因序列为GGCTCTGGCTCT的Linker连接形成一个HTLV-1/2嵌合基因，密码子优化后，进行以上4个基因的合成，再分别插入到PGEX-5X-1原核表达质粒中，分别获得PGEX-HTLV-1-gp46、PGEX-HTLV-1-gp21、PGEX-HTLV-2-gp46、PGEX-HTLV-1/2共4个重组原核表达质粒，再将含HTLV-1的gp46、gp21基因，含HTLV-2的gp46基因以及含HTLV-1/2嵌合基因的重组质粒分别转化到BL21表达菌株，获得能够表达相应蛋白的重组菌株；

所述步骤3)包括：

3-1)制备磁流体：在先通氮气的情况下，在容器中通过Fe³⁺、Fe²⁺、NaOH和水混合反应后制备磁流体；

3-2)制备金磁纳米颗粒：取上述步骤3-1)制得的磁流体，加入氯金酸并搅拌，然后加入过量的盐酸羟胺，再次加入氯金酸，反应后制得Fe₃O₄@Au金磁纳米颗粒；

3-3)对金磁纳米颗粒进行功能化修饰：利用油酸对上述步骤3-2)制得的Fe₃O₄@Au金磁纳米颗粒进行表面改性，使其表面带有大量的羧基，为后续的蛋白偶联提供了偶联位点，以碳二亚胺作为连接因子，将HTLV-1/2重组嵌合多肽抗原的氨基和半胱氨酸的巯基结合到金壳上，得到Fe₃O₄@Au-HTLV-1/2重组嵌合多肽抗原纳米颗粒；

所述步骤5)具体包括：利用上述步骤3)制得的捕获载体Fe₃O₄@Au-HTLV-1/2重组嵌合多肽抗原与待检样本进行水浴反应，特异性的将待检样本中的HTLV-1/2病毒抗体捕获聚集；然后通过磁力吸附将Fe₃O₄@Au-HTLV-1/2重组嵌合多肽抗原-抗体纳米颗粒富集，弃上清；加入磷酸盐缓冲液重悬Fe₃O₄@Au-HTLV-1/2嵌合多肽抗原-抗体颗粒；再将反应液转移到由上述步骤4)制得的层析试纸条的上样孔上，进行层析反应5-10min，有抗体存在的Fe₃O₄@Au-HTLV-1/2嵌合多肽抗原-抗体纳米颗粒将被检测带捕获，金颗粒聚集显色，阳性结果显示红色，没有抗体存在的阴性Fe₃O₄@Au-HTLV-1/2重组嵌合多肽抗原纳米颗粒将不能被检测带捕获而不显色，从而实现HTLV-1/2抗体的检测。

2.根据权利要求1所述的HTLV-1/2抗体的快速检测方法，其特征在于，所述步骤2)包括：将过夜活化的重组表达菌株转接到培养基中进行培养，加入诱导剂，诱导表达，再检测蛋白是否表达及其表达量；扩大培养体积，收菌后将菌液冰浴后进行离心，收沉淀并用菌液裂解缓冲液充分悬浮菌沉淀，进行超声破碎后将破碎完全的菌液进行离心，留上清并过滤，再利用蛋白纯化仪进行纯化，纯化后测定蛋白的含量、检测蛋白纯化结果，并进行蛋白活性鉴定。