[发明专利]用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法

说明书

本发明涉及分子诊断技术领域，具体公开一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法。所述引物和探针序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，其能特异性检测猪流行性腹泻病毒的野毒株。本发明TaqMan实时荧光定量PCR方法利用所述引物和探针对样品进行扩增，若Cq≤36，则判定为阳性，即样品为猪流行性腹泻病毒的野毒株。该方法特异性强，敏感性高，重复性好，临床检出率高，为PED的快速检测与防治提供重要技术手段。

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(PED virus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，主要危害7～10日龄仔猪，引起腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。该病冬季多发，但近年来发病季节性不明显，一年四季均有发生。该病首先在英国暴发，而后遍及全球，我国于1976年首次对PED进行报道。2010年以来， PED在亚洲尤其是中国的流行相当严重，首先在我国华南地区暴发，随后遍及全国大部分省的猪场。此次PED暴发是由PEDV的变异株引起的，其临床症状、发病率和死亡率均比以前的PED严重。主要表现为流行范围广、初生仔猪发病率和死亡率高。

疫苗免疫是当前防控PED的重要措施，以CV777减毒株为代表的活疫苗临床应用普遍，导致常规实验室诊断方法不能快速区分野毒株与疫苗株。ORF3 基因是PEDV的辅助基因，其部分片段的缺失可导致PEDV毒力减弱，是鉴别 PEDV野毒株和疫苗弱毒株的重要靶标。PED的诊断方法有病原学、血清学和分子生物学等多种方法。实时荧光定量PCR技术是由常规PCR技术衍生而来的一种新的高特异性的核酸定量技术，并能够对目的核酸的扩增情况进行实时监测，该技术在病原检测和传染病诊断方面已得到广泛应用。但目前尚未见有根据PEDV野毒株和疫苗毒株ORF3基因序列的差异，鉴别检测PEDV野毒株实时荧光定量PCR技术的报道。

发明内容

针对以上技术现状，本发明提供一种基于ORF3基因序列的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法 (TaqMan FQ-PCR)。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针，其序列如下：

F引物：CGTTTTGCTGTCATTGTTCTT(SEQ ID NO:1)；

R引物：AGACTAAACAAAGCCTGCCAATA(SEQ ID NO:2)；

TaqMan探针：

ATTGCCCACTTTTATATTATTGTGGTGCATTTTTAGATG(SEQ ID NO:3)。

所述TaqMan探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。

引物和探针的设计和筛选对TaqMan FQ-PCR方法的成功与否非常重要。本发明定位于PEDV的保守基因ORF3内部，根据强弱毒株的ORF3基因差异序列设计引物及探针，这样在鉴别PEDV疫苗株和野毒株的前提下保证了 TaqMan FQ-PCR方法的准确性和可靠性。

本发明还提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的试剂盒，其包含上述引物和探针。

优选地，所述试剂盒中还包含猪流行性腹泻病毒野毒株阳性参考品，所述阳性参考品为含有猪流行性腹泻病毒疫苗株RNA和野毒株RNA的质粒。

本发明还提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR方法，包括如下步骤：