[发明专利]一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法

权利要求书

1.一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）一锅法滚环扩增：将1μL浓度为1μmol/L的锁式探针、1μL浓度为10 mmol/L的四种脱氧核糖核苷三磷酸的混合物即dNTPs和8μL的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水即DEPC水混合组成10 μL A预混液，再将2μL 10×Taq DNA 连接酶 Buffer、2μL10× Bst DNA 聚合酶Buffer、1μL浓度为10 nmol/L的待测靶序列、0.5μL 40U/μL的Taq DNA连接酶、0.5μL 8U/μL的Bst DNA聚合酶以及4μL DEPC水混合组成10 μL B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，用移液枪吹打均匀，以上操作均在冰面上进行，然后至于55℃下反应6小时，于80℃下20分钟使酶失活以终止扩增反应；

（2）单核苷酸多态性分型测定：取步骤（1）中的扩增产物5μL、1μL 6×Loading Buffer和0.6μL 100×Syber GreenⅠ工作液，室温放置5分钟，灌胶后点样到质量浓度为1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1×TBE缓冲液，即0.04 mol/L Tris-硼酸，0.001 mol/L EDTA，pH=8.0，在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片；

（3）单核苷酸多态性荧光检测：取步骤（1）中的扩增产物2 μL、2 μL 20×Syber GreenⅠ溶液，用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液pH7.4溶液稀释到100 μL，室温下保持10-15分钟，用350μL的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495 nm，光谱记录范围从505 nm到700nm，在534 nm处测定其荧光信号强度。

2.如权利要求1所述的一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于所述步骤（1）混合后的20μL溶液中含有pH7.6 40 mmol/L Tris-HCl，25 mmol/L KAc，10mmol/L Mg(Ac)₂，10 mmol/L二硫苏糖醇即DTT，1 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NAD，10mmol/L KCl，10 mmol/L (NH₄)₂SO₄，2 mmol/L MgSO₄，质量百分比浓度为0.2% Triton X-100，20U Taq DNA连接酶，4U的Bst DNA聚合酶100 nmol/L锁式探针和500μmol/L的dNTP，0.5 nmol/L目标核酸。