[发明专利]一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法

说明书

本发明公开了一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法。一锅法滚环扩增将常规滚环扩增反应合三为一，将扩增需要的锁式探针、dNTPs等原料构成A溶液，所需的缓冲液，连接酶、聚合酶和目标序列混合构成B溶液，将溶液A和B溶液混合，在一定温度下和一定的缓冲体系下反应扩增所需要的时间。本发明建立了快速简便的一锅法滚环扩增新方法，提供一种简单快速、灵敏度高的单核苷酸多态性的方法，具有操作简便、分析时间短、特异性高、更适于原位检测的特点。

技术领域

本发明涉及一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法，属于分子生物学和核酸化学领域。

背景技术

滚环扩增(RCA)是1998年建立起来的一种恒温核酸扩增方法，它的提出模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，并且研究人员发现这种DNA复制方式存在于很多病毒中。随着连接酶介导的基因检测技术和挂锁探针局部DNA检测技术的出现,滚环扩增技术的发展速度迅速提高。RCA技术是在恒温下以环状单链DNA 为模板进行线性单链扩增，产生上千个环状DNA拷贝衔接而成的DNA单链，不需要特定的热循环仪，并具有灵敏度高、特异性好、操作简便的特点。然而，RCA技术也存在一些不足：① 反应步骤较多，耗时较长。② 选择性较低，兼容性差。③ 难于实现原位检测。因此，建立简单、快速、适合原位检测的RCA方法具有十分重要的理论意义和实用价值。

一锅法（one-pot）反应在纳米粒子制备，有机合成领域已被广泛应用，在生化分析等很多领域也应用越来越多，比如，Storhoff等基于Au纳米颗粒探针的选择性比色多核苷酸检测，实现了在四个单碱基缺陷存在下靶标的一锅法检测，但将一锅法应用于RCA扩增反应尚未见报道。

针对常规RCA技术的不足和一锅法的概念，提出建立一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法，常规RCA需要三步操作，繁琐耗时；一锅法RCA合三为一，简单便捷。这种方法的建立有助于完善miRNA理论和检测技术，拓展生物医学和临床检测，并在生物和医学研究领域具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种一锅法滚环扩增技术检测单核苷酸多态性的方法。

具体步骤为：

（1）一锅法滚环扩增技术：将1μL浓度为1μmol/L的锁式探针、1μL浓度为10 mmol/L的四种脱氧核糖核苷三磷酸的混合物（dNTPs）和8μL的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水(DEPC水)混合组成10 μL A预混液，再将2μL 10×Taq DNA 连接酶 Buffer、2μL10× Bst DNA 聚合酶Buffer、1μL浓度为10 nmol/L的待测靶序列、0.5μL 40U/μL的Taq DNA连接酶、0.5μL 8U/μL的Bst DNA聚合酶以及4μL DEPC水混合组成10μL B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，用移液枪吹打均匀，混合后的20μL溶液中含有40 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)，25mmol/L KAc，10 mmol/L Mg(Ac)₂，10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，1 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH₄)₂SO₄，2 mmol/L MgSO₄，质量百分比浓度为0.2% Triton X-100，20U Taq DNA连接酶，4U的Bst DNA聚合酶100nmol/L锁式探针和500μmol/L的dNTPs，0.5 nmol/L目标核酸;以上操作均在冰面上进行，然后至于55℃下反应6小时，于80℃下20分钟使酶失活以终止扩增反应。