[发明专利]一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法

权利要求书

1.一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：原料预处理

在丰水梨花期，采集铃铛状的花朵，取下成熟花药，待花药开裂后收集花粉，于-20℃条件下密闭保存；

步骤2：制备Fluo 4-AM母液

将50μg的Fluo 4-AM溶解在91.2μL的无水二甲基亚砜中，于-20℃条件下避光密封保存，得到Fluo 4-AM母液；

步骤3：制备花粉悬浮液

将步骤1中的-20℃条件下密闭保存的花粉于常温放置1-2h后，与培养液混匀至最终浓度为1×10⁵-1×10⁷个花粉/mL，于25℃条件下培养0.5-2h，得到花粉悬浮液；

步骤4：制备Fluo 4-AM工作液

分别取1-5μL步骤2得到的Fluo 4-AM母液和10-100μL步骤3得到的花粉悬浮液，混匀后，得到Fluo 4-AM工作液；

步骤5：制备加载荧光染料的花粉管

将步骤4得到的Fluo 4-AM工作液，于负压、低温条件下避光培养0.5-2h，再离心，弃去上清，用培养液洗涤2-3次，即得到加载荧光染料的花粉管。

2.根据权利要求1所述的一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，其特征在于，步骤3和步骤5中，所述培养液均是将溶质溶解在30mM的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液中，其中，所述溶质为蔗糖、聚乙二醇、硼酸和硝酸钙的混合物；在所述培养液中，蔗糖的质量百分比为10％，聚乙二醇的质量百分比为20％，硼酸的质量百分比为0.01％，硝酸钙的质量百分比为0.03％。

3.根据权利要求1所述的一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，其特征在于，步骤5中，所述负压的压力为-50kPa至-100kPa，低温为0-4℃，所述离心的转速12000rpm，时间为1min。