[发明专利]一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法

说明书

本发明公开了一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，属于花粉管加载荧光染料技术领域。所述利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，包括如下步骤：步骤1：原料预处理；步骤2：制备Fluo 4‑AM母液；步骤3：制备花粉悬浮液；步骤4：制备Fluo 4‑AM工作液；步骤5：制备加载荧光染料的花粉管。本发明在不影响花粉细胞结构和活性的情况下，采用负压渗透及染色剂染色，在低温下对花粉管进行处理，能够对花粉管中钙离子成功染色。

技术领域

本发明涉及一种利用负压渗透在花粉管加载荧光染料的方法，属于花粉管加载荧光染料技术领域。

背景技术

植物细胞中游离的Ca²⁺和其结合的蛋白质是植物信号网络内重要的组成者和参与者，植物细胞质中Ca²⁺的变化受环境刺激，与细胞的发育和生长又密切相关。在植物受刺激的情况下，细胞质中的Ca²⁺浓度很容易发生短暂的变化，另外花粉管尖端伸长过程中，需要胞外Ca²⁺向内流动维持尖端的Ca²⁺梯度，但目前关于Ca²⁺流动机制尚不甚清楚，因此探究一种可以用来准确反映植物细胞内Ca²⁺浓度变化的试验方法就显得尤为重要，这有助于进一步了解Ca²⁺在细胞内的功能。

Ca²⁺的荧光成像技术是一种比较直观的有效用来研究细胞内Ca²⁺作用的方法。植物细胞中的Ca²⁺荧光成像主要有两种：一种是基于基因编码的绿色荧光蛋白为Ca²⁺指示剂，但此种方法需进行基因转化，耗时太长；另一种是具有荧光的有机小分子探针。常采用的小分子探针是Flou-3，Flou-4等，这些试剂不容易适过脂质的细胞膜。为了透过膜，荧光试剂前加一个脂头，但是细胞膜上有脂酶，在常温下易去掉这个脂头，而使荧光试剂不易透过细胞膜，因此有大量关于荧光试剂如何透过细胞膜，进入细胞内与钙结合产生荧光的研究。Ca²⁺依赖荧光信号很大程度上依赖于染料加载的方法，为促进这些小分子探针进入植物细胞，一种方法是通过显微注射的方法直接将探针注入细胞内，但这种发法对设备仪器的要求比较高，不利于广泛使用。另一种比较常用的方法是低温装载法，可避免细胞中的酯酶的酶解作用，但耗费时间偏长，一般需要过夜等。

目前最成功和广泛使用的技术是将荧光探针直接微注射到植物细胞的细胞质中，但这种方法非常繁琐和耗时。其次是使用酯和酸类物质对植物原生质体进行非侵入性辅助加载，但由于原生质体失去了细胞壁和极性，它们的反应可能并不能准确反应其生理机制。用于检测花粉管细胞内Ca²⁺的染料或方法，在染色剂透过花粉细胞壁结合胞内Ca²⁺时大部分对花粉粒细胞结构造成伤害，使花粉失去活性。虽然目前存在许多荧光染料与具有细胞渗透性的乙酰甲酯结合透过细胞壁，结合激光共聚焦显微镜的使用可以检测不同刺激下植物细胞中Ca²⁺的空间分布变化的方法，但是这种方法又必须在低温条件下来避免细胞中酯酶对染色剂的酶解作用，加载时间较长，降低了试验效率。

中国发明专利申请号为201510944828.7的《一种花粉管装载荧光染料的方法》，公开了一种花粉管装载荧光染料的方法。该发明专利采用细胞裂解液辅助装载，其缺点是裂解液的使用破坏了花粉细胞壁和细胞膜的结构使花粉细胞失去活力。

综上，目前有许多关于使用负压渗透相关的报道，通过负压辅助的方法促进基因载体渗透进入细胞，在无植物组织培养和再生的情况下获得基因转化株。也有报道成功使用负压转化的方法进行不同种类植物的基因转化。在负压条件下，细菌可以渗透进入到植物的部分器官进行转化，可以显著提高转换效率。但目前并没有关于采用负压渗透的方法促进染色剂进入细胞进行染色的相关研究。鉴于此，有必要提出一种花粉管加载荧光染料的负压渗透方法，已解决现有技术的不足。

发明内容