[发明专利]一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法

说明书

本发明提供一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，利用少量D‑[U‑¹³C]葡萄糖作为示踪物和内标的同位素稀释法，结合适应性改编的核磁单量子相关实验(ID‑HSQC)，测定相应的双峰和单峰的积分比值，以此计算血浆中内、外源性葡萄糖浓度。本发明具有样品制备简单(不需要除蛋白及衍生化等前处理步骤)、同位素标记示踪物用量少，能同时准确测定血浆中内、外源中葡萄糖浓度等优点。

技术领域

本发明属于分析化学方法领域，具体涉及一种基于稳定性同位素稀释法(isotopedilution,ID)结合二维核磁共振技术用于快速、准确测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度的定量方法。更具体地说，涉及一种以D-[U-¹³C]-葡萄糖作为标记物(示踪物)，改编单量子相关核磁实验(HSQC)以测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度的方法(ID-HSQC)。

背景技术

葡萄糖是人及动物的重要能源物质，在能量代谢中扮演着重要角色。血糖的监测对多种疾病的诊断和治疗具有重要意义，通常血糖浓度的测定是利用酶反应的方法在自动分析仪上测试完成的。然而该方法并不能区分血样中内、外源性葡萄糖，而内、外源性葡萄糖的含量测定是在临床上研究葡萄糖代谢，胰岛素敏感性等实验中的重要参数。目前用于这些临床实验的方法主要方法有：气相色谱-质谱联用方法(GC-MS)、气相色谱-同位素比值质谱联用方法(GC-IRMS)、液相色谱-同位素比值质谱联用方法(LC-IRMS)以及液相色谱-串联质谱联用方法(LC-MS/MS)。但这些方法大多需要除蛋白，衍生化等繁琐的前处理步骤，以及需要相对较大量的同位素示踪物等缺点。因此开发样品前处理简单、同位素标记物用量较少又能准确测定血样中内、外源性葡萄糖的定量方法将具有重要实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于稳定性同位素稀释法(isotope dilution,ID)结合二维核磁共振技术用于快速、准确测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度的定量方法。更具体地说，涉及一种以D-[U-¹³C]-葡萄糖作为标记物(示踪物)，改编单量子相关核磁实验(HSQC)以测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度的方法(ID-HSQC)。本发明利用较低浓度的D-[U-¹³C]-葡萄糖(～0.035mM)作为标记物的同位素稀释法(Isotope Dilution)，结合改编的单量子相关核磁实验(HSQC)，简单、准确、快速地同时测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，利用少量D-[U-¹³C]葡萄糖作为示踪物和内标的同位素稀释法，结合适应性改编的核磁单量子相关实验(ID-HSQC)，测定相应的双峰和单峰的积分比值，以此计算血浆中内、外源性葡萄糖浓度。

一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，该方法包括下述步骤：

样品制备：取适量的血浆，加入少量氘代试剂，混匀后转移到核磁管；

核磁实验：在常规灵敏度增强单量子相关实验的脉冲序列基础上，将碳通道的180度非选择性重聚脉冲改为葡萄糖1号位¹³C¹化学位移选择性重聚脉冲，从而消除δ1，δ2及随后2τ时间内碳碳耦合的演化，即消除了碳碳耦合对谱图相位的影响；在脉冲序列的开始阶段加入90-G_Z单元消除碳-13纵向磁化矢量；利用改编的脉冲序列采集二维HSQC实验数据，数据经正弦平方窗函数变迹、零填充、傅立叶变换、相位校正得图谱，积分获取对应信号的积分值；

浓度计算：利用核磁实验获得的积分值，通过下面的公式计算出内、外源葡萄糖摩尔浓度比值，