[发明专利]一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法及番石榴叶悬浮细胞的应用

权利要求书

1.一种番石榴叶悬浮细胞的应用，将所述番石榴叶悬浮细胞用于生产次生代谢产物，其特征在于，所述番石榴叶悬浮细胞的培养方法包括以下步骤：

（1）采集番石榴成熟叶片，洗净后进行表面灭菌处理，切块得到外植体；

（2）将步骤（1）中得到的外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养得到愈伤组织；

（3）将步骤（2）中得到的愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行继代培养得到增殖愈伤组织；

（4）将步骤（3）中得到的增殖愈伤组织接种至液体培养基中进行继代培养，培养过程中保持振荡，继代培养更换培养液时，用吸管取出单细胞或小细胞团进行下一代振荡培养；最终得到只含有单细胞或小细胞团的培养物，将这些培养物混匀即得到番石榴叶悬浮细胞；

生产次生代谢产物的过程在番石榴次生代谢产物培养用装置中进行，所述番石榴次生代谢产物培养用装置包括培养罐体、培养液储罐与用于放置所述番石榴叶悬浮细胞的多层培养架；所述培养罐体包括外培养罐（5）与设于所述外培养罐（5）内的内培养罐（4），所述培养液储罐包括第一培养液储罐（12）与第二培养液储罐（14），所述多层培养架包括可拆卸固设于所述内培养罐（4）内的圆形培养架（6）和可拆卸固设于所述外培养罐（5）内的环形培养架（7）；所述内培养罐（4）通过第一连接管（9）与第一培养液储罐（12）连通形成第一密闭空间，所述外培养罐（5）通过第二连接管（8）与第二培养液储罐（14）连通形成第二密闭空间，且所述第一密闭空间与所述第二密闭空间互不连通；所述内培养罐（4）上设有用于通过气压调节第一培养液储罐（12）中培养液是否进入内培养罐（4）的第一气压调节系统，所述外培养罐（5）上设有用于通过气压调节第二培养液储罐（14）中培养液是否进入外培养罐（5）的第二气压调节系统；

所述愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中加入1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、1.0mg/L NAA，所述MS培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8-6.0；

所述愈伤组织增殖培养基为在MS培养基中加入0.1mg/L KT与1.0mg/L 2,4-D，所述MS培养基中添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，所述愈伤组织增殖培养基的pH值为5.8-6.0；

所述液体培养基为在MS培养基中加入0.1mg/L KT与1.0mg/L 2,4-D，所述MS培养基中添加蔗糖30g/L，所述液体培养基的pH值为5.8-6.0。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，诱导培养得到愈伤组织的培养条件为：培养温度为23-27℃，以日光灯为光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间控制为12h/d，培养30天。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，继代培养得到增殖愈伤组织的培养条件为：培养温度为23-27℃，以日光灯为光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间控制为12h/d，每30天继代一次，继代3-5次。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）中，继代培养的培养条件为：接种量为3g/25mL、培养温度为23-27℃，暗培养或弱光培养，摇床转速为110-120rpm，继代培养的次数为3-4次，每12天继代一次。