[发明专利]一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法及番石榴叶悬浮细胞的应用

说明书

本发明公开了一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)采集番石榴成熟叶片，洗净后进行表面灭菌处理，切块得到外植体；(2)将外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养得到愈伤组织；(3)将愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行继代培养得到增殖愈伤组织；(4)将增殖愈伤组织接种至液体培养基中进行继代培养，培养过程中保持振荡，继代培养更换培养液时，用吸管取出单细胞或小细胞团进行下一代振荡培养；最终得到只含有单细胞或小细胞团的培养物，将这些培养物混匀即得到番石榴叶悬浮细胞。本发明还提供一种上述番石榴叶悬浮细胞的应用。本发明的方法具有生产成本低、生产周期短、生产效率高等优点。

技术领域

本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法及应用。

背景技术

植物细胞悬浮培养是植物细胞生长的微生物化。由于其分散性好，细胞形状及细胞团的大小大致相同，而且生长迅速，重复性好，易于控制的有利因素，被广泛运用于生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及遗传学、分子生物学的研究。它可以直接用于原生质体分离、培养与杂交以及用来生产次级代谢产物，悬浮细胞培养技术已经成为植物生物技术中最为有用的手段之一。植物细胞悬浮培养已经广泛应用于育种和生产次级代谢产物，在生物工程中发挥着重要的作用。

番石榴叶中含有丰富的营养物质，新鲜成熟的番石榴叶中含有较高的蛋白质和可溶性糖。同时含有黄酮类、多酚类、三萜类、杂源萜类、挥发油、植物多糖等功能活性成分。研究表明番石榴叶提取物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗微生物、抗腹泻、抗肿瘤及保护肝脏的作用。

利用番石榴叶进行组织培养技术及植物细胞悬浮培养技术，可以实现番石榴叶次生代谢产物的工业化生产，它的产量高，生产周期短，成本低，生产过程可以人为控制，不受环境如气候，季节、土壤等因素的影响。番石榴叶的悬浮细胞的制备目前是一项空白的领域，具有很高的开发和应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种生产成本低、生产周期短、生产效率高的番石榴叶悬浮细胞的培养方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种番石榴叶悬浮细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)采集番石榴成熟叶片(靠近顶芽且充分展开的叶片)，洗净后进行表面灭菌处理，切块(每块材料需带有中脉)得到外植体；

(2)将步骤(1)中得到的外植体接种至愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养得到愈伤组织；优选的，上述愈伤组织为经过筛选出的颜色、质地均一，疏松而无定型的愈伤组织；

(3)将步骤(2)中得到的愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行继代培养得到增殖愈伤组织；

(4)将步骤(3)中得到的增殖愈伤组织(优选为疏松的增殖愈伤组织)接种至液体培养基中进行继代培养，培养过程中保持振荡，继代培养更换培养液时，用吸管(规格为2mL)取出单细胞或小细胞团进行下一代振荡培养；最终得到只含有单细胞或小细胞团的培养物，将这些培养物混匀即得到番石榴叶悬浮细胞。

上述培养方法中，优选的，所述步骤(1)中，洗净后进行表面灭菌处理包括以下步骤：将番石榴叶片用流水冲洗，用洗衣粉溶液(优选质量浓度为0.1％)漂洗3min，再用流水反复冲洗，然后在超净工作台用75％的酒精浸泡10-15s，无菌水冲洗后，再用0.1％的升汞溶液消毒5-10min，再次用无菌水冲洗。

上述培养方法中，优选的，所述愈伤组织诱导培养基为在MS培养基中加入1.0mg/L6-BA、1.0mg/L 2,4-D、1.0mg/LNAA，所述MS培养基中添加蔗糖30-40g/L，琼脂7g/L，所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8-6.0。