[发明专利]一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)以中国大豆花叶病毒SC3的cDNA为模板，设计的SMV病毒基因组分段扩增引物A-NotI、B-KpnI、C-KA、D-AA、E-AC，引物中引入酶切位点，利用高保真酶分段扩增SMV基因组；选择扩增引物对应的内切酶NotI、KpnI、AgeI、ApaI、ClaI分别酶切SMV病毒基因组扩增片段和载体骨架，并通过T4连接酶连接；采用此方法依次将SMV基因组的片段与载体骨架PBR322相连，使SMV病毒基因组完整的连接到载体骨架中，并修复载体中SMV基因组出现的碱基突变，获得SMV侵染性克隆载体PSMV:SC3；其中扩增引物A-NotI上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；扩增引物B-KpnI上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；扩增引物C-KA上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；扩增引物D-AA上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示；扩增引物E-AC上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.12所示；

(2)利用引物MluI-NotI和SmaI-KpnI以载体PSMV:SC3为模板进行PCR扩增，在SC3病毒基因P1和Hc-Pro处通过酶切连接的方法替换PSMV:SC3中的原有片段，并引入多克隆位点SmaI和MluI,于多克隆位点处插入外源蛋白YFP基因序列，构建成含荧光蛋白YFP的侵染性克隆载体PSMV:YFP；所述的引物MluI-NotI上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物序列如SEQ ID NO.22所示；扩增引物B-KpnI上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物序列如SEQ ID NO.24所示。

2.根据权利要求1所述的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于所述的中国大豆花叶病毒SC3的cDNA通过在感病大豆品种南农1138-2上人工接种大豆花叶病毒SC3株系，发病后取大豆花叶病症状典型的叶片提取SMV病毒RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA获得。

3.根据权利要求1所述的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于SMV侵染性克隆载体PSMV:SC3序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于以质粒pEarleyGate101为模板，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示引物PCR扩增获得YFP基因序列。

5.按照权利要求1-4中任一项所述的构建方法构建的含荧光蛋白YFP的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体PSMV:YFP。

6.权利要求5所述的含荧光蛋白YFP的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体PSMV:YFP在SMV在大豆体内运动踪迹可视化研究中的应用。

7.权利要求5所述的含荧光蛋白YFP的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体PSMV:YFP在DNA水平上开展RNA病毒在SMV研究中的应用。