[发明专利]一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用。本发明通过分段酶切连接的方法将SMV中国株系SC3基因组构建至载体PBR322中，成功构建了SMV全长cDNA侵染性克隆载体，并将报告基因YFP插入到SMV基因组P1和Hc‑Pro之间，含报告基因YFP的侵染性克隆载体可以在荧光显微镜下直接观察大豆体内YFP的表达(绿色荧光)，从而确定SMV出现的位置和时间。本发明通过表型分析、RT‑PCR和ELISA等多种方法对SC3侵染性克隆载体的侵染活性进行检测，证明该载体在感病大豆品种南农1138‑2中具有侵染活性。该载体能够实现在DNA水平上开展RNA病毒SMV的相关研究。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用。

技术背景

大豆为一年生草本植物，起源于中国，在我国已有5000多年的种植历史。大豆含有丰富的蛋白质、脂肪及一些对人体有益的活性成分，能够为人类提供植物蛋白和油脂。大豆花叶病毒(SMV)病严重影响着大豆的产量和品质，且在我国及世界各大豆产区均有发生。大豆花叶病毒(SMV)为RNA病毒，构建侵染性克隆载体可以实现在DNA水平上开展SMV致病机理等多方面的研究，解决了RNA病毒基因组难以操作的难题。

植物病毒侵染性克隆可以分为侵染性cDNA克隆和具有侵染能力的体外转录物两种类型。侵染性cDNA克隆是将植物病毒的全长cDNA构建在35S启动子的下游，将载体直接摩擦接种或者用基因枪轰击的方法使载体进入宿主细胞内，成功进入宿主细胞的cDNA在35S启动子的作用下先转录成病毒RNA，再通过复制达到侵染植物的目的。侵染性体外转录物，主要是基于一些噬菌体强启动子构建载体，病毒基因组与噬菌体启动子相连构建载体，将载体线性化后在体外利用相应的RNA聚合酶转录出具有侵染性的RNA。本发明所构建的侵染性克隆载体属于侵染性cDNA克隆载体。

植物病毒侵染性cDNA克隆的构建根据植物病毒基因组的不同而有所差别，一些基因组较小的病毒可直接利用RT-PCT进行反转录获得病毒全基因组。基因组较大的植物病毒由于反转录酶与基因组受二级结构的影响不适合用RT-PCT直接获得病毒全基因组。一般采用的 cDNA合成的方法有：1、直接在体外拼接构建全长cDNA；2、设计特异引物，利用RT-PCR分段克隆病毒cDNA，然后对获得的片段逐步拼接，最后将全序列整合到载体骨架中。3、先扩增部分cDNA片段并将其构建到载体骨架中，然后扩增剩余部分将其连接到中间载体，再通过酶切连接的方法整合到载体中，从而完成侵染性载体的构建。本发明采用的是第3种方法。

侵染性克隆载体能够实现DNA水平上开展RNA病毒分子的相关研究，从而深入地了解病毒与寄主间的互作机制，因此，其应用范围非常广泛。主要包括1、用于研究寄主及病毒的基因功能；2、与血清学、体外翻译及序列分析技术相结合能提高其检测效率；3、在侵染性克隆基础上，通过添加一个或多个多克隆位点构建新植物病毒表达载体以开展双分子荧光互补、大豆体内蛋白互作和免疫共沉淀等研究。

发明内容

本发明的目的在于针对中国没有大豆花叶病毒中国株系且含报告基因(YFP)侵染性克隆载体的问题，提供一种构建中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的方法。

本发明的另一目的在于提供构建的中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体。

本发明的又一目的在于提供提供该中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种中国大豆花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，包含以下步骤：