[发明专利]DNA双标记效率检测方法

说明书

本发明提供了一种DNA双标记效率检测方法，包括：制作两份具有荧光标记的互补单链DNA溶液，记为溶液A和B；制作没有荧光标记的序列相同的两条互补单链DNA溶液，记为溶液C和D；调节溶液A～D，使单链DNA的浓度一致；将等体积的溶液A和B以及缓冲液混合退火处理，得到溶液一；将等体积的溶液A～D混合，进行退火处理，得到溶液二；将溶液一和溶液二分别通过预设的激光共聚焦荧光相关谱光路中进行探测计算，分别获取溶液一和溶液二的荧光分子处于三态的比例p₁和p₂，以及溶液一和溶液二的相关曲线的y轴截距G₁(0)和G₂(0)，通过预置算法计算DNA双标记效率DDLE。借此，本发明可以更精确的计算DNA双标记效率。

技术领域

本发明涉及DNA双标记检测技术领域，尤其涉及一种DNA双标记效率检测方法。

背景技术

荧光标记的DNA在科学研究中被广泛应用于各种生物学研究中，以及精准定量检测方面^(1-5)。特别是用同样染料标记在两端的DNA样品，在定量研究中具有单标记、不同种荧光标记所不具备的特殊功能，如：能够定量测定酶促反应动力学进程^(6-9)。然而目前的定量化研究受到DNA标记效率的影响。就目前的技术而言，完全百分之百标记DNA样本是很难达到的。所有的试剂公司出售的荧光标记的DNA样本都会含有没标记的DNA掺杂其中。尽管人们想用各种办法去除其中的未标记DNA样本，但是由于荧光标记的DNA样本和未标记的样本理化性质极其相似，将其除尽很难做到。目前为止，对于不同类型荧光染料的标记效率差别很大，根据染料差不同荧光标记效率波动范围在48-65％之间，也有高达90％^(10,11)。

合成的双链DNA往往由互补单链DNA经退火产生。在单链DNA荧光标记不完全的情况下，退火产生的双链DNA就会有四种组成：两端双荧光标记的双链DNA，一端单荧光标记的双链DNA，另一端单荧光标记的双链DNA，完全没有标记的双链DNA。在大多数情况下，未标记的DNA在实验中由于不能被探测，并不影响实验结果。因此，测定双端标记的DNA在所有荧光标记DNA 中的比例额外重要，将为生物学的定量研究提供前提依据。这种双端标记的DNA分子在所有荧光标记的DNA分子中所占的比例，被定义为DNA双标记效率，即DNA doublelabeling efficiency(DDLE)。到目前为止，尚无有效的测定DDLE 的方法。

吸光光度法⁽¹²⁾很难测量DDLE。传统的光谱方法利用DNA的光谱吸收去 DNA的浓度往往是依赖经验公式，例如，传统认为1OD 260nm的吸光度折合 50mg/L的双链DNA。但是这个方法有着巨大的缺陷，就是误差很大，尤其是对短DNA片段或者特殊序列的DNA浓度测定上，误差更大⁽¹³⁾。并且即便使用光谱法测定了DNA的浓度，也欠缺一种方法去测定荧光染料的浓度。主要原因是当荧光染料分子结合DNA后其荧光属性会发生变化^(14,15)，正因如此缺乏有效的经验公式，从吸光光度法角度去测量DDLE很难实现。

目前测定单链DNA荧光标记效率的方法有着很大局限性。据报道可以通过放射性标记法去测定单链DNA的标记效率⁽¹¹⁾。该方法核心是用磷32去标记单链DNA，然后通过电泳分离出荧光标记和没有荧光标记的单链DNA，最后通过放射性的量来分辨不同组份的DNA的量。该方法的关键是电泳能够区分标记和没标记的单链DNA，为此荧光分子的标记必须足以引起单链DNA电泳能力的显著变化。然而随着DNA分子量的增加，一个荧光分子导致的电泳能力的变化越来越不明显，因此这种方法往往仅能测量极其短小的DNA的标记效率。

然而，即便我们通过某种方法得知了DNA单链标记效率，也很难通过单链 DNA的荧光标记效率去推测双链DNA的标记效率。在DNA退火形成双链的过程中，一部分染料会被退火的高温破坏，导致DNA单链的有效标记效率降低，因此也无法简单通过退火前单链DNA的标记效率去推断DDLE。

参考文献