[发明专利]一种基于数字PCR的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法

权利要求书

1.一种基于数字PCR的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤

(1)纯品阿胶质量与DNA浓度含量测定及关系确定：分别提取不少于10个质量梯度的阿胶标准品DNA，每个质量梯度重复3次；并利用紫外分光光度核酸定量测定仪测定标准品DNA浓度，确定出在一定质量范围内的纯品阿胶质量与DNA浓度含量的线性关系，并列出纯品阿胶质量与DNA浓度含量关系方程式为y＝ax±b，相关系数需满足R²≥0.990，其中y是阿胶DNA浓度含量，单位ng/μL；x是纯品阿胶质量，单位mg；

(2)阿胶DNA质量含量与目的基因拷贝数测定及关系确定：在数字PCR检测的浓度范围内，分别稀释至并选取10个质量梯度的阿胶标准品DNA进行数字PCR检测，每个浓度梯度重复3次；确定出在一定的阿胶DNA浓度范围内，DNA质量含量与目的基因拷贝数之间的线性关系，并列出关系方程式为Y＝cX±d，相关系数需满足R²≥0.990，其中Y是目的基因拷贝数，单位copies/μL；X为反应体系中阿胶DNA质量含量，单位ng；

(3)纯品阿胶质量与目的基因拷贝数关系确定：根据步骤(1)确立的纯品阿胶质量与阿胶DNA浓度含量之间的关系，以及步骤(2)确立的阿胶DNA质量含量与目的基因拷贝数之间的关系，以阿胶DNA含量为中间过渡换算值，确定出纯品阿胶质量与目的基因拷贝数之间的线性关系，并列出关系方程式为M_阿胶＝eC±f；其中，M_阿胶为纯品阿胶质量，单位mg；C为每微升的目的基因拷贝数，单位copies/μL；

DNA浓度含量和质量含量的中间过渡关系式为X＝v*y/n，其中v为扩增体系中DNA的上样体积，n为DNA模板的稀释倍数；

(4)待测阿胶产品的定量确定：利用数字PCR检测待测样品中基因拷贝数，采用步骤(3)所述关系式换算出相应纯品的阿胶理论质量，所述阿胶的理论质量与进行DNA提取的阿胶总质量的比值即为待测阿胶的纯度。

2.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述数字PCR的扩增体系为：采用20μL体系，上下游引物各1.8μL，探针0.8μL，数字PCR Mix 10μL，模板4μL，无菌水补齐至20μL；利用微滴生成器将20μL反应液生成不低于15000个DNA模板和试剂随机分布的微滴；数字PCR反应程序如下：95℃10min；94℃30s；60℃1min；98℃10min；40个循环，4℃保存，最后用微滴分析仪对扩增产物进行分析。