[发明专利]一种基于数字PCR的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种基于数字PCR的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法，属于分子生物学技术领域。该方法首先确定出在一定质量范围内阿胶质量与DNA浓度含量的线性关系以及在一定浓度范围内DNA质量含量与DNA绝对拷贝数的线性关系，以DNA含量为中间换算值，从而换算出阿胶质量与DNA绝对拷贝数的线性关系，利用ddPCR检测出待测样品的绝对拷贝数来确定阿胶及阿胶制品中阿胶的绝对含量。有益效果：本申请利用ddPCR对待测样品进行DNA拷贝数的精确计数，定量结果准确、高效、稳定，能有效对市售的各类阿胶产品进行定量检测和纯度鉴定，有较大的应用价值和应用前景，可有效预防阿胶掺假现象的发生。

技术领域

本发明涉及一种基于数字PCR的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

阿胶是采用马科动物驴的鲜皮或干燥皮经去毛漂泡、煎煮、浓缩、并加入各类辅料制成的固体胶类药物，也被称为驴皮胶。其与人参、鹿茸三者一起被称为“中药三宝”，首载于《神农本草经》，并被列为上品。阿胶具有滋阴补血，润燥，止血的功效，其补血功效已被证实。除补血外，阿胶在增强免疫力、抗疲劳、抗辐射、抑制肿瘤、保护大脑、促进骨愈合生长以及保护心血管等方面的功效都已被证实。由于其重要性，阿胶产业现已融入健康中国发展战略。

目前，阿胶行业进入了空前的发展期，市场增幅逐年提高，从而让驴皮处于供不应求的局面。然而，我国驴存量逐年下降，行业驴皮资源紧张，原料供应严重不足。在巨大利益的诱惑下，以其他动物廉价皮甚至工业明胶冒充驴皮等故意制假售假现象严重。这种方式熬制出来的“假阿胶”虽在外观、气味、质地、口感等方面与真阿胶无明显差异，但阿胶纯度低。有些掺假阿胶甚至威胁人体健康，严重扰乱了阿胶市场秩序。当前，阿胶的真假鉴别和纯度鉴定是该行业急需解决的瓶颈难题。

为解决阿胶行业存在的种种问题，辨别阿胶真伪，许多学者已做了大量卓越的工作，开创了各类检测方法，包括高效液相色谱法、高效液相质谱法、光谱法、酶联免疫法、电泳法以及分子生物学方法等。这些方法能有效辨别阿胶是否掺假，但无法对阿胶纯度进行评估，因此依然无法对阿胶的品质进行评价。要从根本上解决阿胶行业存在的问题，不仅要进行定性分析，更重要的是对阿胶定量分析。由于技术上的难点，目前行业内阿胶定量分析研究极少，几乎处于研究空白。

发明内容

为解决上述技术难题，本发明提供了一种基于数字PCR的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法。该方法可实现阿胶的绝对定量，准确、高效、稳定，可对市场上阿胶产品进行纯度测定，从而突破现阶段无法对阿胶及其相关产品进行纯度评价的难题。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种基于数字PCR的阿胶及阿胶制品中阿胶成分的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)纯品阿胶质量与DNA浓度含量测定及关系确定：分别提取不少于10个质量梯度的阿胶标准品DNA，每个质量梯度重复3次；并利用紫外分光光度核酸定量测定仪测定标准品DNA浓度，确定出在一定质量范围内的纯品阿胶质量与DNA浓度含量的线性关系，并列出纯品阿胶质量与DNA浓度含量关系方程式为y＝ax±b，相关系数需满足R²≥0.990，其中y是阿胶DNA浓度含量(ng/μL)，x是纯品阿胶质量(mg)；

(2)阿胶DNA质量含量与目的基因拷贝数测定及关系确定：在数字PCR检测的浓度范围内，分别稀释至并选取10个质量梯度的阿胶标准品DNA进行数字PCR检测，每个浓度梯度重复3次；确定出在一定的阿胶DNA浓度范围内，DNA质量含量与目的基因拷贝数之间的线性关系，并列出关系方程式为Y＝cX±d，相关系数需满足R²≥0.990，其中Y是目的基因拷贝数(copies/μL)，X为反应体系中阿胶DNA质量含量(ng)；