[发明专利]特异抑制3β-HSD基因表达的shRNA重组载体构建与应用

说明书

本发明涉及一种抑制3β‑HSD基因表达的干扰性shRNA、重组载体及其构建方法和应用。一种抑制3β‑HSD基因表达的干扰性shRNA，包括依次连接的靶序列、茎环结构、所述靶序列的互补序列以及终止位点，其中，所述靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，所述靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，所述靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。上述干扰性shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中3β‑HSD基因的表达。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种特异抑制3β-HSD基因表达的shRNA重组载体构建与应用。

背景技术

3β-羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)广泛分布于脑、心脏、肾脏、脂肪、皮肤及甾体激素生成组织中，主要参与糖皮质激素、盐皮质激素以及性激素合成，发挥限速酶作用。由于3β-HSD催化类固醇激素生成的起始步骤，若其表达异常，则可能影响所有类固醇激素的合成。

有研究表明，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)可引起3β-HSD mRNA和蛋白表达水平升高，DEHP能够通过影响类固醇激素合成过程中3β-HSD表达水平的变化，从而产生生殖毒性作用。

在转录水平调控基因表达方面，RNA干扰(RNAi)被广泛应用于特异抑制基因的表达及其功能研究。在现有RNA干扰技术中，以质粒为载体将小干扰RNA(siRNA)导入细胞内，专一作用于靶向基因的细胞系。siRNA与载体质粒组成的表达载体可以在短时间内沉默3β-HSD基因的表达，但其存在干扰效果明显、转染效率低、细胞毒性大且无法实现长效稳定干扰的缺点。现有技术中尚无转染效率高且可长效稳定表达、特异抑制3β-HSD基因表达的shRNA表达载体。

发明内容

基于此，有必要针对现有技术中RNA干扰沉默3β-HSD基因的表达的效果不明显且效果不稳定的问题，提供一种抑制3β-HSD基因表达的干扰性shRNA、重组载体及其构建方法和应用。

一种抑制3β-HSD基因表达的干扰性shRNA，包括依次连接的靶序列、茎环结构、所述靶序列的互补序列以及终止位点，其中，

所述靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，

所述靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，

所述靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。

在其中一个实施例中，所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.4所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.5所示；或者，

所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.6所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQID No.7所示；或者，

所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.8所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQID No.9所示。

一种抑制3β-HSD基因表达的重组载体，包括慢病毒载体及插入在所述慢病毒载体中的上述干扰性shRNA。

在其中一个实施例中，所述慢病毒载体为pCMV-VSV-G，所述pCMV-VSV-G包括BamHI酶切位点、EcoRI酶切位点及KpnI酶切位点，所述干扰性shRNA包括BamHI酶切位点粘性末端及EcoRI酶切位点粘性末端。

一种抑制3β-HSD基因表达的重组载体的构建方法，包括以下步骤：

提供上述抑制3β-HSD基因表达的干扰性shRNA；及

将上述抑制3β-HSD基因表达的干扰性shRNA插入慢病毒载体中，得到所述抑制3β-HSD基因表达的重组载体。

一种抑制3β-HSD基因表达的慢病毒，通过如下步骤制得：