[发明专利]一种酵母表达载体的构建方法及其制备木聚糖酶的方法和应用

权利要求书

1.一种酵母表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用PCR进行体外扩增获得香菇木聚糖酶基因片段，所述香菇木聚糖酶基因片段的序列为SEQ ID NO：l；

(2)以香菇木聚糖酶基因片段构建pMD-Xyn载体；

(3)利用限制性内切酶对pMD-Xyn载体进行酶切，胶回收木聚糖酶基因片段；

(4)利用限制性内切酶酶切pPICZαA载体；

(5)将步骤3中胶回收的木聚糖酶基因片段与步骤4中酶切后的pPICZαA载体连接，导入大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化大肠杆菌构建pPICZαA-Xyn载体，再利用质粒提取试剂盒从重组大肠杆菌中提取pPICZαA-Xyn载体；

所述pPICZαA-Xyn载体基因序列为SEQ ID NO：2；

步骤(2)中所述构建pMD-Xyn载体的方法为：以木聚糖酶基因片段连接pMD 18-T载体，转化大肠杆菌构建pMD-Xyn载体，所述pMD 18-T载体基因序列为SEQ ID NO：3。

2.根据权利要求1所述的一种酵母表达载体的构建方法，其特征在于，所述限制性内切酶为限制性内切酶EcoR I和Xba I。

3.根据权利要求1所述的一种酵母表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(5)中导入大肠杆菌感受态细胞DH5α的方法为热击法。

4.一种利用酵母表达载体制备木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用限制性内切酶Sac I对权利要求1-3任一项中所述的pPICZαA-Xyn载体进行线性化：

(2)将线性化的pPICZαA-Xyn载体通过电穿孔仪转入毕赤酵母菌X33，再置于含山梨醇和博来霉素的YPD培养基中进行筛选，获得含木聚糖酶基因的重组酵母菌菌落；

(3)将含木聚糖酶基因的重组酵母菌菌落加入到BMGY培养基中，25-30℃震荡培养至浑浊，离心收集菌体，将菌体加入到含博来霉素的BMMY培养基中，培养2-3天，每天加入甲醇以维持甲醇终浓度为0.5-1.5%；

培养终止后，将培养液离心，过0.45μm滤膜，再经浓缩管浓缩和Ni柱亲和层析，获得纯化的木聚糖酶。

5.根据权利要求4所述的一种利用酵母表达载体制备木聚糖酶的方法，其特征在于，步骤(1)中所述线性化的体系为：10×QuickCut buffer 5μL，Sac I 1μL，质粒8μL，灭菌水36μL，37℃孵育15min。

6.根据权利要求4所述的一种利用酵母表达载体制备木聚糖酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述通过电穿孔仪转入商用酵母菌X33的条件为：电压2-2.5kv；时间4-6ms。

7.根据权利要求4所述的一种利用酵母表达载体制备木聚糖酶的方法，其特征在于，步骤(3)中所述BMGY培养基组成包括如下重量份的组分：酵母粉1份，蛋白胨2份，酵母氮源基础1.34份，生物素4×10^-5份，pH为6.0的甘油1份；还包括在每升培养基中加入100mmol的磷酸钠缓冲液。

8.根据权利要求4所述的一种利用酵母表达载体制备木聚糖酶的方法，其特征在于，步骤(3)所述含博来霉素的BMMY培养基组成包括如下重量份的组分：酵母粉1份，蛋白胨2份，酵母氮源基础1.34份，生物素4×10^-5份，pH为6.0的甲醇1份；还包括在每升培养基中加入100mmol磷酸钠缓冲液，每亳升培养基中加入12-60μg博来霉素。

9.一种利用木聚糖酶提高农作物秸秆瘤胃利用率的方法，其特征在于，所述方法为：在每克秸秆饲料中添加权利要求4-8任一项所制备的木聚糖酶300-500μg。