[发明专利]一种酵母表达载体的构建方法及其制备木聚糖酶的方法和应用

说明书

本发明公开了一种酵母表达载体的构建方法，包括以下步骤，以木聚糖酶基因片段构建pMD‑Xyn载体，利用限制性内切酶对pMD‑Xyn载体进行酶切，胶回收木聚糖酶基因片段，利用限制性内切酶酶切pPICZαA载体，将胶回收的木聚糖酶基因片段与酶切后的pPICZαA载体连接，导入大肠杆菌感受态细胞DH5α，转化构建pPICZαA‑Xyn载体。本发明基于香菇菌在发酵秸秆过程中能够产生木聚糖酶有效降解秸秆中木质纤维素的主要成分木聚糖，以其木聚糖酶基因构建了一种含木聚糖酶基因的酵母表达载体，以为木聚糖酶的商业化生产、秸秆类饲料的反刍动物利用方面提供理论基础和技术支撑。

技术领域

本发明属于酶制备领域，涉及木聚糖酶的制备，具体涉及一种酵母表达载体的构建方法及其制备木聚糖酶的方法和应用。

背景技术

我国农业领域每年产生大量的农作物秸秆，以稻草、玉米秸秆、小麦秸秆为典型代表。这些秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素等碳水化合物，是反刍动物的重要饲料来源(赵蒙蒙等，几种农作物秸秆的成分分析，材料导报，2011(16)：122-125)。但生产中，这些秸秆并没有被广泛的用于畜牧养殖业，大部分被直接焚烧(曹国良等，中国区域农田秸秆露天焚烧排放量的估算，科学通报，2007(15)：1826-183)或腐解还田，不仅浪费了资源，还严重污染环境。究其原因在于，秸秆中的木质纤维素结构复杂，瘤胃可消化性低，尽管瘤胃中存在大量能够降解粗纤维的微生物，但对秸秆的降解率仍低于50％，若使用不当，还会影响动物采食量，降低生产性能(Vallejo,L.H.,et.al.Effects of xylanase supplementationon feed intake,digestibility and ruminal fermentation in Rambouilletsheep.Journal of Agricultural Science,2016.154(6):1110-1117)。以往多采用酸化、碱化等方式处理油菜秸秆，但其残留的酸碱，会对动物本身造成伤害，而且污染环境(张文杰等，秸秆处理方法的研究进展，中国畜牧兽医，2011(07)：30-33)。与上述化学方法相比，利用能够降解纤维素或半纤维素的酶制剂，则绿色、安全、无污染，且可提高饲料的适口性和利用率。木聚糖是半纤维素的的主要成分，平均可占到稻草、玉米秸秆、小麦秸秆半纤维素的60％以上(Sun,R.C.,J.Tomkinson.Characterization of hemicelluloses obtainedby classical and ultrasonically assisted extractions from wheatstraw.Carbohydrate Polymers,2002.50(3):263-271；Karimi,K.,et al.Conversion ofrice straw to sugars by dilute-acid hydrolysis.BiomassBioenergy,2006.30(3):247-253；Moniz,P.,et al.Characterisation and hydrothermal processing of cornstraw towards the selective fractionation of hemicelluloses.Industrial CropsProducts,2013.50(50):145-153)。因此，生产中通常会采用增加瘤胃木聚糖消化率来提高反刍动物对秸秆的利用。木聚糖酶可将木聚糖降解为可溶性糖，这使得添加木聚糖酶成为提高木聚糖以及半纤维素瘤胃消化的最常用方法。然而，尽管做了较多研究，但木聚糖酶在反刍动物生产中的效果，各研究间结论并不一致。在一些研究里，木聚糖酶能够提高稻草、玉米秸秆、小麦秸秆的体外瘤胃发酵和降解率(He Z.X.,et al.Efficacy of exogenousxylanases for improving in vitro fermentation of forages.Journal ofAgricultural Science,2015,153(3):538-553)，但在其他研究里并没有表现出这些效果(Giraldo,L.A.,et al.In vitro ruminal fermentation of low-quality forages asinfluenced by the treatment with exogenous fibrolytic enzymes.Options Méditerranéennes Série A Séminaires Méditerranéens,2007:263-267)。导致出现这种不一致的原因有很多，但木聚糖酶的来源、活性、使用方法是其中的最主要原因(Beauchemin,K.A.,et al.Use of Exogenous Fibrolytic Enzymes to Improve Feed Utilization byRuminants.Journal of Animal Science,2003.81(14suppl 2):E37-E47)。