[发明专利]基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法在审
| 申请号： | 201810813577.2 | 申请日： | 2018-07-23 |
| 公开（公告）号： | CN108949824A | 公开（公告）日： | 2018-12-07 |
| 发明（设计）人： | 张涌;袁梦珂;韩静;吴腾;高元鹏;韦永可 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;C12N5/10;C12Q1/66 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 712100 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 阳性克隆细胞 供体载体 胎儿成纤维细胞 转基因克隆 策略获得 转基因牛 介导 牛胎儿成纤维细胞 发情 转基因克隆牛 特异性表达 表达载体 胚胎移植 药物筛选 嘌呤霉素 传统的 电穿孔 共转染 核供体 核酸酶 启动子 受体牛 吞噬性 转基因 位点 子宫 成活 胚胎 切割 细胞 | ||
1.一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体，其特征在于，该供体载体包括目的基因Ipr1以及用于将Ipr1基因通过HMEJ方法介导的重组定点插入牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间的元件序列。
2.根据权利要求1所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体，其特征在于，所述元件序列包括用于打靶位点同源介导的重组的同源臂序列，同源臂以牛cDNA为模板扩增，扩增产物分别为牛28号染色体上打靶位点的上游792bp和下游790bp；打靶位点位于牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。
3.根据权利要求1所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体，其特征在于，所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。
4.根据权利要求4所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体，其特征在于，所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。
5.一种检测潜在打靶位点切割效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：以293T细胞为宿主细胞，通过共转染针对打靶位点的SSA报告载体和CRISPR/Cas9表达载体，基于SSA修复途径将存在重复序列的萤火虫荧光素酶基因恢复成完整表达框，通过不同打靶位点对应的萤火虫萤光素酶表达量确定打靶位点的切割效率。
6.一种插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体，基于HMEJ的方法将目的基因Ipr1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述共转染操作采用电穿孔法。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基于HMEJ的方法插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞可作为生产转基因克隆牛的核移植操作供体细胞使用。
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