[发明专利]基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法

说明书

本发明公开了一种利用Cas9切割核酸酶基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法分别将HMEJ策略的供体载体与HR策略的供体载体和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中MSR1启动子可以使Ipr1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。HMEJ策略获得阳性克隆细胞的效率高于传统的HR策略。以HMEJ策略获得的转基因阳性克隆细胞为核供体，获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终获得成活的Ipr1定点插入转基因克隆牛。

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆牛的核供体细胞的构建，特别涉及一种利用Cas9切割核酸酶基于HMEJ的方法介导Ipr1基因定点插入获取打靶的牛胎儿成纤维细胞的方法。

背景技术

牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染所引起的一种人畜共患病，牛结核病与人结核病可以相互传染，蔓延很快。牛患结核病后严重消瘦，产奶量下降，人感染则消瘦无力、呼吸困难致死。结核病既制约着畜牧业的发展，又威胁着人类健康。

Ipr1(intracellular pathogen resistance 1，细胞内病原体抵抗因子1)基因是介导结核分枝杆菌天然免疫的一个基因，该基因能够调节巨噬细胞的死亡方式和限制结核分枝杆菌在巨噬细胞内的繁殖(Behar，2011)。Ipr1基因在巨噬细胞中特异性表达，结核分枝杆菌感染或干扰素处理增强其表达(Pan et al.2005)。Ipr1基因的发现为预防牛结核病的流行和传播提供了一种新思路。

随着动物生物技术的发展，CRISPR/Cas9系统在任意物种的任一基因组位置上插入DNA片段，成为科研工作者们研究基因功能、生产转基因动物，发展新的基因治疗疗法治疗遗传性疾病的强力工具。

应用转基因技术实现家畜的品种改良具有巨大的应用潜力。通过转基因技术增强家畜对于结核杆菌的抗性，对于未来的牛结核病的预防和治疗具有重大意义。但是，提高CRISPR/Cas9介导的精确基因编辑或HDR介导的基因敲入(knock-in，KI)的效率，特别是对于转基因家畜育种而言仍然是一个重大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用Cas9切割核酸酶基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，可以采用Cas9与Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体获取Ipr1基因在牛28号染色体M-S位点(即牛MAT1A基因和SFTPA1基因间区域内特定序列片段)定点整合的牛胎儿成纤维细胞，以该细胞作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体(简称pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ)，该供体载体包括目的基因Ipr1以及用于将Ipr1基因通过HMEJ方法介导的重组定点插入牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间的元件序列。

所述元件序列包括用于打靶位点同源介导的重组的同源臂序列和其两侧的打靶位点序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛28号染色体上打靶位点的上游792bp和下游790bp；打靶位点位于牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。

所述目的基因Ipr1是由巨噬细胞清道夫受体1启动子启动转录。

所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。

所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。