[发明专利]一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法

权利要求书

1.一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在2.0mL离心管中加入1-3000ug的待处理人粪便总DNA；

(2)在步骤(1)离心管中加入100-300μL亚硫酸盐转化溶液、30-50μL保护溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀，瞬时离心；

(3)将步骤(2)离心管密闭置于恒温振荡孵育器中，95℃静置孵育10～20分钟；

(4)立即将步骤(3)离心管取出，放置冰上5-10分钟；

(5)将步骤(4)离心管从冰上取出，颠倒混匀，瞬时离心，将离心管置于恒温振荡孵育器中，75℃静置孵育45-60分钟；

(6)瞬时离心步骤(5)反应后的离心管，向其中加入1000μL磁珠结合溶液、100-200μL混匀的磁珠溶液，涡旋混匀，其中，磁珠预先混匀且室温平衡至少30分钟；

(7)将步骤(6)离心管置于23℃的恒温振荡孵育器中，转速1000rpm，孵育45-60分钟；

(8)瞬时离心离心管后，将其置于磁力架2-5分钟，待磁珠分离后，弃除上清液；

(9)将步骤(8)离心管从磁力架上取下，加入800μL磁珠结合溶液；涡旋混匀重悬磁珠；重复步骤(8)；

(10)将步骤(9)离心管从磁力架上取下，加入800μL洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；

(11)将步骤(10)离心管从磁力架上取下，加入600μL洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；

(12)瞬时离心步骤(11)离心管后，将其置于磁力架2-5分钟，去除残留液体；

(13)打开步骤(12)离心管的管盖，将离心管放置于恒温振荡孵育器中；23℃静置15分钟，等待磁珠干燥，静置时不要震荡；

(14)向步骤(13)离心管加入35μL洗脱液；盖好离心管；涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡孵育器中，23℃，1000rpm，孵育10分钟；

(15)瞬时离心步骤(14)离心管后，将其置于磁力架2-5分钟，将洗脱液转移至新的无DNase无RNase酶的1.5mL离心管中；-80℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，所述亚硫酸盐转化溶液为含40％-50％(m/v)亚硫酸氢钠和5％-15％(m/v)亚硫酸钠的水溶液，pH值为5.4-5.5。

3.根据权利要求1所述的人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，所述保护溶液为按100-200mg：1.5mL比例配置的奎诺二甲基丙烯酸酯与二乙二醇二甲醚的混合液。

4.根据权利要求1所述的人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，所述磁珠结合溶液为含0.1％-0.5％PEG6000(v/v)、0.1％-0.5％PEG8000(v/v)、5％-10％氯化钠(m/v)、5-10mM EDTA(pH8.0)、5-10mM Tris-HCl(pH7.6)和体积浓度为50％无水乙醇的水溶液，pH7.5-7.6。

5.根据权利要求1所述的人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，所述洗涤液为含体积浓度为70％-80％乙醇的水溶液。

6.根据权利要求1所述的人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，所述步骤(14)和(15)的洗脱液为无核酸酶水或Tris缓冲液或TE缓冲液。

7.根据权利要求1所述的人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，所述磁珠溶液为含浓度为50mg/mL纳米磁性颗粒的水溶液，所述纳米磁性颗粒为超顺四氧化三铁或超顺三氧化二铁颗粒，且颗粒外表由表面修饰有羟基或羧基的二氧化硅包被。