[发明专利]一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法

说明书

本发明提供一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，采用热变性法95℃10‑20分钟后，立即冰置5‑10分钟防止复性，然后将DNA在75℃进行转化45‑60分钟，并采用磁珠法以及含PEG6000/8000的结合液对转化DNA进行纯化，能够得到高转化率、高质量的甲基化DNA，有利于甲基化检测的标准化及全自动化操作，用于后续粪便样本中人源DNA中基因的甲基化水平分析。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体的说，它涉及一种人粪便总DNA在恒温条件、变性剂及DNA保护试剂条件下，使用亚硫酸盐溶液转化DNA，并使用纯化试剂进行转化产物回收的方法。

背景技术

甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化，本发明涉及的是DNA甲基化。

DNA甲基化(DNAmethylation)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)，其经DNA甲基转移酶催化，胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化是一种表观(epigenetic)遗传修饰，它在不改变DNA序列的情况下，对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用，并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中是可以稳定传递的。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与细胞癌变、肿瘤的发生、发展有着密切的联系。

DNA甲基化的分析方法有多种，如BSP、MSP等方法，但都需要提前将DNA进行亚硫酸盐转化后，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会被转化。

目前市面上常见的亚硫酸盐转化试剂盒基本步骤分为：DNA氢氧化钠变性、亚硫酸盐变温转化及脱磺酸基、脱盐和洗脱。但是该类亚硫酸盐转化试剂盒存在的主要问题有：1)采用氢氧化钠将DNA变性，而后进行长时间的转化及变温过程，且需要氢氧化钠溶液进行脱磺酸基。在此过程中，会导致DNA严重降解及片段化；2)基本都是采用离心柱法进行产物纯化，部分试剂盒还需要carrier RNA，造成DNA损耗高、回收效率降低，且难以实现自动化操作；3)目前市面尚无专门针对人粪便DNA样本进行亚硫酸盐处理的试剂盒，而已有的商业化试剂盒对于人粪便DNA的亚硫酸盐处理的CT转化率和回收率比较低，对于人源DNA的后续甲基化分析产生较大影响。

因此，基于目前表观遗传学的快速发展需求，以及现有亚硫酸盐转化及纯化方法的一些问题，本发明对变性、转化及纯化方法进行了优化改进。

发明内容

本发明的目的是解决以上提出的问题，提供一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，对变性、转化及纯化方法进行了优化改进，采用热变性法95℃10-20分钟后，立即冰置5-10分钟防止复性，然后将DNA在75℃进行转化45-60分钟，并采用磁珠法以及含PEG6000/8000的结合液对转化DNA进行纯化，能够得到高转化率、高质量的bis-DNA(bis代表甲基化)，并有利于甲基化检测的标准化及全自动化操作，用于后续粪便样本中人源DNA中基因的甲基化水平分析。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明是一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，包括如下步骤：

(1)在2.0mL离心管中加入1-3000ug的待处理人粪便总DNA(甲基化DNA或未甲基化DNA)，DNA浓度为10ng/μL时推荐用量为20-200μL；

(2)在步骤(1)离心管中加入100-300μL亚硫酸盐转化溶液、30-50μL保护溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀，瞬时离心；

(3)将步骤(2)离心管密闭置于恒温振荡孵育器中，95℃静置孵育10-20分钟；